 導讀 抗生素在畜牧生產中的濫用，導致抗藥、耐藥、殘留及超級病菌的產生，已引起了世界各國的普遍關注。許多國家已經禁止抗生素作為飼料添加劑，尋找一種綠色環保型抗生素替代品———微生態制劑也就應運而生。益生菌是一種微生物補充劑，通過改善宿主腸道微生物菌群平衡，對宿主產生有益的效果。益生菌之所以對人和動物體的健康有益，與其生物學特性緊密相關，可幫助宿主提高營養物質的消化利用率。益生菌能黏附在人和動物腸道黏膜上生長繁殖，是其產生有益作用的前提之一。當益生菌在腸道內定植并大量繁殖后，可競爭性地與病原微生物爭奪營養物質，并產生相應的細菌素等生物活性物質，來抑制病原微生物的生長和繁殖，從而提高機體的健康水平。譬如乳酸菌產生的乳酸等有機酸能降低腸道pH值，在動物處于應激狀態時亦能維持腸道內環境的穩定，防止病原菌因勢而起；還有一些益生菌能產生抗菌肽，從而抑制有害菌的生長。益生菌能刺激腸道黏膜，產生黏膜免疫應答，增強體液和細胞免疫，促進抗炎因子的產生，減少炎癥反應。研究表明乳酸菌能激活巨噬細胞，增強對致病菌的殺滅作用，提高黏膜免疫相關因子的表達水平，從而提高機體免疫力。 仔豬由于胃腸道發育不健全，同時在其生長過程還伴隨著斷奶、飼料變化、轉舍等應激因素，將會導致仔豬腸道菌群紊亂，易引發疾病，致使仔豬成活率低。目前，益生菌廣泛應用于我國養豬業生產中。研究發現，在哺乳仔豬的教槽料中添加復合益生菌，可提高仔豬日增重，降低仔豬腹瀉率和死亡率，并降低仔豬生長前期糞便中大腸桿菌數量及提高乳酸菌數量，對改善腸道健康具有重要意義。另據報道，利用嗜酸乳桿菌和枯草芽孢桿菌灌服哺乳仔豬，發現益生菌能顯著提高仔豬日增重、血清免疫球蛋白含量及腸道乳酸桿菌數量，降低仔豬腹瀉率和糞便中大腸桿菌數量，并對小腸絨毛的發育有促進作用。由于不同的益生菌及其組合具有不同的益生功能，研究和開發新的復合益生菌對仔豬的健康生產具有重要意義。 本研究根據益生菌對病原菌生長和繁殖的抑制作用，制成干酪乳桿菌和糞腸球菌的復合液體制劑，以哺乳仔豬為試驗對象，探索益生菌對乳仔豬生長性能和健康狀況的影響，為哺乳仔豬健康生長提供良好的理論和實踐指導。 1、材料與方法 1.1 菌種選擇 試驗選用干酪乳桿菌（Lactobacillus Casei）和糞腸球菌（Enterococcus faecalis）菌種均購自中國科學院微生物研究所，并由河南農業大學動物營養與生物技術研究室保存。根據本研究室前期的工作基礎，確定干酪乳桿菌和糞腸球菌的比例為3∶1時，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌生長的抑制能力最強，并以此配比進行下一步的哺乳仔豬試驗。 1.2 培養基及培養方法 培養干酪乳桿菌和糞腸球菌的乳酸細菌培養基（MRS）組成：胰蛋白胨15ｇ、酵母浸粉1ｇ、葡萄糖20ｇ、吐溫－80 1mL、磷酸氫二鉀2ｇ、乙酸鈉5ｇ、檸檬酸銨2ｇ、硫酸鎂0.2ｇ、硫酸錳0.05ｇ，用蒸餾水定容至1L，在MRS液態培養基中加入1.5％瓊脂可制備MRS固態培養基，2種培養基在121℃、0.15MPa高壓蒸汽滅菌20min備用。干酪乳桿菌和糞腸球菌37℃靜置培養24ｈ，測定培養液的活菌數，分裝并于4℃保存備用，使用前調整2種菌活菌數為1×109 CFU／mL。糞便中乳酸菌數量的測定采用厭氧管滾管培養法，在37℃下靜置培養48ｈ。微生物數量的表示方法，以每1mL或1ｇ樣品中所含的菌落數（CFU）為標準，以自然對數值（Lｇ）表示。 培養大腸桿菌的伊紅美藍鑒別培養基（EMB，北京奧博星）組成：稱取EMB 42.5ｇ，加入1L蒸餾水，在121℃、0.15MPa高壓滅菌20min，制備含培養基的平皿備用。大腸桿菌37℃靜置培養48ｈ，其菌落呈現亮紫色。 1.3 試驗設計及動物的飼養管理 試驗選擇品種相同（長白×大白×杜洛克三元雜交）、出生日期和體質量相近的仔豬15窩，每窩選擇8頭，共120頭仔豬，分為4個處理組，每個處理組15個重復，每個重復2頭仔豬（公母各半）。對照組，灌服生理鹽水；試驗Ⅰ組：灌服干酪乳桿菌培養液；試驗Ⅱ組：灌服糞腸球菌培養液；試驗Ⅲ組：灌服干酪乳桿菌和糞腸球菌混合培養液。 試驗從仔豬出生開始持續至21日齡斷奶，并延續1周，試驗期為28ｄ。所選仔豬均在同一豬舍內，舍內清潔干燥、通風良好，舍內溫度和相對濕度分別為（25±2）℃和65％～70％。仔豬保育箱內第1周和第2周溫度分別為（33±2）℃和（30±2）℃，然后維持在（25±2）℃。試驗期間飼養管理和免疫程序均按規模化豬場統一要求執行。仔豬出生第1天灌服1mL益生菌制劑，以后每隔7ｄ灌服1次，每次遞增1mL至21日齡，對照組灌服生理鹽水。仔豬7日齡后開始添加教槽料至28日齡，期間自由采食和飲水。 1.4 生長性能的測定 在仔豬出生后，稱取每頭仔豬的初始體質量；在21，28日齡時，分別稱取每頭仔豬的體質量，并計算仔豬的日增重。每天觀察仔豬精神狀態及腹瀉情況（以糞樣顏色及是否水樣等為準），計算腹瀉率及死亡率。腹瀉率＝仔豬腹瀉頭次／試驗頭數／試驗天數×100％；死亡率＝仔豬死亡頭數／試驗頭數×100％。 1.5 胃腸道消化酶活性和pH值的測定 選擇對照組和復合益生菌組21日齡仔豬各3頭，心臟放血處死，采集消化道各段的內容物各5ｇ，分別于4℃和－20℃保存，用于測定各腸道內容物中微生物數量和消化酶活性。蛋白酶的測定參照國家標準（1999）推薦的中性蛋白酶活的測定方法，即福林法。蛋白酶活性的定義為：在40℃條件下，每1min產生1μｇ酪氨酸定義為1個蛋白酶活力單位（U）。蛋白酶活（U／ｇ）＝測得的酪氨酸含量／反應時間×4×樣品稀釋倍數／樣質量。淀粉酶活性采用DNS法，淀粉酶活性定義為每1min產生1ｍｇ葡萄糖所用酶量為1個酶活力單位（U）。淀粉酶活（U／ｇ）＝樣品中還原糖含量×樣品稀釋液總體積×稀釋倍數／樣品質量／測定所用酶體積／5。另外，取適量胃腸道內容物于試管中，用pHＳ－2Ｃ酸度計測定樣品pH值。 1.6 糞樣及胃腸道微生物菌群的測定 于21，28日齡，每組分別采集5頭仔豬的無污染糞樣5ｇ，于4℃保存，用于乳酸菌和大腸桿菌的活菌數測定。具體操作如下：分別準確稱取0.5ｇ樣品加入4.5mL生理鹽水（稀釋液測定大腸桿菌）或MRS溶液（稀釋液測定乳酸菌），依次進行10倍梯度稀釋至1×10-6。采用稀釋涂布平板法和伊紅－美藍固態培養基測定大腸桿菌活菌數；利用厭氧管和固態MRS培養基測定乳酸菌活菌數。2種菌分別在37℃培養48ｈ，然后進行計數。 1.7 血清生化指標的測定 在仔豬21日齡斷奶當天，每組選取5頭仔豬進行前腔靜脈采血，血液于4℃傾斜放置過夜，分離上層血清于－20℃保存備用。利用全自動血液生化分析儀進行血清各項指標的測定。 1.8 數據統計和分析 數據分析采用SPSS軟件進行方差統計分析，各處理組間平均值采用Duncan氏多重比較進行差異顯著性檢驗，結果用（ｘ±ｓｘ）表示，以P<0.05表示差異顯著。 2、結 果 2.1 益生菌對哺乳仔豬生產性能的影響 2.1.1 益生菌對哺乳仔豬增重的影響 由表1可知，試驗組仔豬21，28日齡平均日增重均顯著高于對照組（P<0.05），其中以試驗Ⅲ組最高，3個試驗組之間差異不顯著（P>0.05）。  由表2可知，試驗Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ組21日齡仔豬死亡率分別比對照組降低了58.46％，43.13％，64.82％（P<0.05），腹瀉率分別比對照組降低了53.59％，53.10％，55.30％（P<0.05）；斷奶7ｄ內3個試驗組仔豬腹瀉率分別比對照組降低了62.60％，51.93％，70.26％（P<0.05）。  2.2 益生菌對仔豬糞樣及胃腸道消化酶活性和pH值的影響 從表3可知，復合益生菌組仔豬胃、十二指腸和結腸中蛋白酶活性顯著高于對照組（P<0.05），十二指腸和盲腸中淀粉酶活性也顯著高于對照組（P<0.05），而胃和十二指腸中的pH 值則顯著低于對照組（P<0.05）。表4結果表明，除試驗Ⅲ組28日齡仔豬糞樣蛋白酶活力顯著高于對照組和試驗Ⅰ組外（P<0.05），其余各組不同年齡段仔豬糞樣中蛋白酶和淀粉酶活性均無顯著性差異（P>0.05）。  2.3 益生菌對仔豬糞樣及消化道微生物菌群的影響 由表5可知，復合益生菌可顯著提高仔豬直腸內容物中乳酸菌的數量，降低回腸中大腸桿菌數量（P<0.05），對其余各腸段內容物中乳酸菌和大腸桿菌數量皆無顯著性影響（P>0.05）。表6的結果顯示，試驗Ⅱ，Ⅲ組28日齡仔豬糞樣中乳酸菌數量顯著高于對照組（P<0.05），但益生菌對仔豬糞樣中大腸桿菌數量皆無顯著性影響（P>0.05）。  2.4 益生菌對仔豬血清生化指標的影響 表7結果表明，試驗Ⅲ組仔豬血清中ALT和AST指標均顯著低于對照組（P<0.05），而IgA 含量顯著高于對照組（P<0.05）；試驗Ⅰ、Ⅱ組血清IgG含量均顯著高于對照組（P<0.05），而試驗Ⅲ組與對照組相比差異不顯著。試驗Ⅲ組血清中谷氨酰轉肽酶（GGT）含量與對照組相比差異不顯著，但顯著低于試驗Ⅰ，Ⅱ組（P<0.05）；其他血清生化指標各處理組間無顯著性差異（P>0.05）。  3.1 益生菌對仔豬生長性能及腹瀉率和死亡率的影響 益生菌進入動物腸道后與機體存在互利共生的關系，益生菌依賴動物機體的環境生存，同時能幫助機體利用不能直接利用的營養物質，將其轉化成易于吸收的小分子化合物供機體利用，以此來提高動物的生長性能。大量的研究發現，添加0.1％復合乳酸菌的仔豬日增重和腹瀉率與抗生素組相比差異不顯著，同時又顯著高于普通對照組，并且血清IGA的含量顯著高于對照組和抗生素組；通過對出生仔豬灌服植物乳桿菌及復合益生菌制劑，均能顯著降低仔豬腹瀉率，并提高日增重；在仔豬日糧中添加0.3％乳酸菌和芽孢桿菌的復合制劑，發現能降低哺乳仔豬的腹瀉率和死亡率。GIANG等研究表明，不同乳酸菌組合可改善仔豬腸道微生物區系，顯著提高斷奶2周內仔豬日采食量和日增重，而對斷奶3～5周后的仔豬沒有顯著性影響。另據報道，給哺乳仔豬灌服屎腸球菌雖然可提高仔豬的日增重，但對仔豬的斷奶體質量無顯著性影響；同時還發現屎腸球菌雖可緩解腹瀉的嚴重性，但對縮短腹瀉病程及對腹瀉的治療無顯著作用。不同研究由于所選用的菌種和飼養管理條件不同，會產生不同的試驗結果。本研究結果與之前的大多數報道一致，充分說明益生菌在提高哺乳仔豬生長及降低腹瀉率和死亡率方面的生物學功能，特別是對剛斷奶仔豬的效果尤為明顯，對于緩解因仔豬斷奶所造成的胃腸道微生物區系紊亂和內環境應激具有重要意義。另外，本研究還發現復合益生菌對哺乳仔豬的益生功效與單一的干酪乳桿菌或糞腸球菌相比無顯著性差別，可根據生產實際來選擇使用單一或復合益生菌。 3.2 益生菌對仔豬血清生化指標的影響 血清ALT和AST的活性是衡量肝臟生理狀況的重要指標，當肝細胞受到損傷時，血清ALT的活性就會升高，同時AST／ALT的比值降低。本研究飼喂復合益生菌組豬血清ALT和AST含量與對照組相比明顯降低，說明復合益生菌對肝臟功能有一定的保護作用。血清免疫球蛋白包括IgA、IgG和IgM 等，由B淋巴細胞產生，是體液免疫的主要效應因子，具有預防和增強機體抗感染的能力，血清免疫球蛋白水平的高低是衡量體液免疫的重要指標。IgA是機體分泌到體液中的主要抗體，動物出生時主要是通過母乳獲得免疫球蛋白（主要是IgA）來增強自身的免疫力。之前研究表明雙歧桿菌與唾液乳桿菌組合可以顯著提高28日齡仔豬血清免疫球蛋白（IgA，IgG和IgM）的含量。本研究也發現益生菌可以顯著提高仔豬血清IgA和IgG的含量，這主要是由于益生菌具有激活腸道免疫應答系統的功能。通過對哺乳仔豬灌服益生菌有助于仔豬盡早地建立起自身的體液免疫系統，增強機體的抗病和抗感染能力，減少疾病發生。 3.3 益生菌對仔豬胃腸道微生物菌群、pH值和酶活的影響 本研究發現，益生菌可在一定程度上提高仔豬直腸和糞便中乳酸菌的數量，而降低回腸中大腸桿菌的數量，可能是由于所灌服的干酪乳桿菌和糞腸球菌在胃腸道中定植、生長和繁殖，并占居優勢地位所致。研究表明，通過在仔豬的飼料中加入微生態制劑，可顯著提高胃腸道中乳酸菌數量而降低大腸桿菌數量。與本研究給乳仔豬灌服益生菌的結果一致，充分說明外源益生菌的引入可改變仔豬胃腸道的微生物區系，從而減少消化道疾病的發生。朱群等研究發現，添加復合益生菌（植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌組合）的哺乳仔豬胃和十二指腸pH值顯著降低，并發現益生菌組仔豬盲腸、空腸和回腸內容物中pH 值與基礎日糧和抗生素組相比均有所下降。本研究結果表明，益生菌組豬各腸道內容物的pH值均低于對照組，其中胃和十二指腸的pH值下降顯著，主要是由于益生菌自身產生的有機酸所致，這種酸性腸道環境可抑制致病菌的生長，有利于仔豬健康。此外，通過豬消化道中蛋白酶和淀粉酶活力的變化可以看出，添加益生菌可顯著提高豬十二指腸中這2種酶的活力。由于干酪乳桿菌和糞腸球菌皆不分泌蛋白酶和淀粉酶，因而這2種酶活的提高可能是由于添加的益生菌刺激了腸道中可分泌這類消化酶的微生物的生長和繁殖所致，有利于營養物質消化、吸收和利用率的提高。 本研究結果表明，定期地給哺乳仔豬灌服單一的干酪乳桿菌或糞腸球菌及2種組合菌，能夠顯著提高哺乳仔豬的日增重和血清免疫球蛋白IGA 和IgG的水平，降低仔豬腹瀉率和死亡率；復合益生菌可提高胃腸道中蛋白酶和淀粉酶的活性及乳酸菌數量，并降低大腸桿菌數量。該研究對哺乳仔豬的健康生產具有一定的指導意義。 注：本文由生物飼料開發國家工程研究中心（BFC）小編整理發布，如有任何建議或意見及投稿等，請您加小編微信（13260429991）交流互動。 參考文獻略 責編：馬維軍；審閱：于繼英 博士 來源：中國獸醫學報；作者：王國強，朱群，常娟等 轉載此文請保留虛線內的所有內容 |
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