集約化養(yǎng)豬中，為提高母豬在生產(chǎn)中的利用率，常常采用早期斷奶和超早期斷奶技術(shù)，但同時也導(dǎo)致了仔豬采食量下降、日增重降低、腹瀉頻發(fā)等問題[1]。雖然抗生素的使用有效地緩解了這一問題，但大量使用抗生素的同時，會造成了動物腸道菌群紊亂、細(xì)菌耐藥性變強(qiáng)、免疫力下降、藥物殘留等問題。隨著無抗時代的到來，植物精油作為一種綠色、安全、穩(wěn)定、有效的原料已得到國內(nèi)外畜牧養(yǎng)殖的關(guān)注，成為替代抗生素的研究熱點(diǎn)。
植物精油（plant essential oils，PEO）是一類由醛類、酚類及醇類等化學(xué)分子組成的揮發(fā)性芳香物質(zhì)，具有廣泛的抗菌、抗炎、抗氧化等生物活性[2]。植物精油作為一種新型的飼料添加劑，具有良好的抗菌殺菌、增強(qiáng)機(jī)體胃腸道蠕動等功能，用于提高機(jī)體免疫力，提高生長性能以及飼料生物利用率等[3]。史東輝等（2013）[4]研究發(fā)現(xiàn)，植物精油能提高肉仔雞抗氧化能力，顯著改善肉雞胴體品質(zhì)。Khattak等（2014）[5]研究表明，飼料中添加植物精油可明顯的改善肉仔雞生長性能。周選武等（2017）[6]在飼糧中添加200 mg/kg植物精油具有改善仔豬血常規(guī)、增強(qiáng)免疫力、促進(jìn)生長性能的功效，但植物精油的醛、酚不同配比對動物機(jī)體的作用效果是不同的。不同精油成分之間存在協(xié)同和拮抗作用，因此精油配比會直接影響到復(fù)合效果，本試驗(yàn)保留抑菌消炎能力較強(qiáng)的肉桂醛和百里香酚，以香芹酚和丁香酚為變量，對比復(fù)合植物精油與抗生素的養(yǎng)殖試驗(yàn)效果的同時，還可比較相同精油含量、不同精油配比的復(fù)合植物精油Ⅰ、Ⅱ之間的試驗(yàn)效果。為植物精油在現(xiàn)代化生豬無抗養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供試驗(yàn)參考。
1.1 試驗(yàn)材料
抗生素：土霉素鈣50 mg/kg+硫酸大觀霉素22 mg/kg+鹽酸林可霉素22 mg/kg；復(fù)合植物精油Ⅰ：總精油含量≥15%，其中肉桂醛9%、百里酚3%、香芹酚3%；復(fù)合植物精油Ⅱ：總精油含量≥15%，其中肉桂醛9%，百里酚3%，丁香酚3%。
1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼糧
試驗(yàn)采用單因子設(shè)計(jì)，選用96頭遺傳背景相同、發(fā)育正常的健康早期“杜×長×大”斷奶仔豬（22~24日齡），根據(jù)體重、性別及健康狀況等均衡分布原則，隨機(jī)分為4組（A、B、C、D組）。A組為基礎(chǔ)組（飼喂基礎(chǔ)日糧），B組為抗生素組（飼喂基礎(chǔ)日糧+土霉素鈣50 mg/kg+硫酸大觀霉素22 mg/kg+鹽酸林可霉素22 mg/kg），C組為復(fù)合植物精油Ⅰ組（飼喂基礎(chǔ)日糧+400 mg/kg復(fù)合植物精油Ⅰ），D組為復(fù)合植物精油Ⅱ組（飼喂基礎(chǔ)日糧+400 mg/kg復(fù)合植物精油Ⅱ），每組3個重復(fù)，每個重復(fù)8頭，試期周期28 d。
試驗(yàn)為玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧，參照NRC（2012）斷奶仔豬營養(yǎng)需求進(jìn)行設(shè)計(jì)，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。
該試驗(yàn)在江西全南縣某豬場進(jìn)行，為封閉式豬舍，試驗(yàn)期為28 d，采用群飼投喂方式，各組每間隔4 h加料飼喂（8:00~20:00）自由采食和飲水，防疫、消毒、驅(qū)蟲等程序按照豬場實(shí)際規(guī)程進(jìn)行，試驗(yàn)期間不對任何仔豬使用藥物。
1.4 指標(biāo)測定及方法
1.4.1 生長性能
試驗(yàn)期內(nèi)觀察記錄試驗(yàn)仔豬生長狀況，按重復(fù)準(zhǔn)確記錄飼料消耗量，并計(jì)算各組的總采食量（TFI）和平均日采食量（ADFI）。試驗(yàn)仔豬于試驗(yàn)進(jìn)行第1、14、28 d時空腹12 h后稱重，記錄各組試驗(yàn)仔豬的末體重（FBW），計(jì)算增重（DG）和平均日增重（ADG）。根據(jù)仔豬ADFI和ADG計(jì)算料重比（F/G）。
1.4.2 腹瀉評分
試驗(yàn)期間每天8：00、12：00和16：00觀察仔豬排糞情況并評分。
腹瀉指數(shù)[分/(頭·d)]=腹瀉評分之和/(天數(shù)×每天評分次數(shù)×頭數(shù))
1.4.3 血清生化指標(biāo)
試驗(yàn)仔豬于試驗(yàn)結(jié)束第2 d（29 d）喂料前進(jìn)行頸部靜脈采血5 ml，每個重復(fù)選1頭接近平均體重的斷奶仔豬，采集的血液于臨時制冷設(shè)備中傾斜置放，待血清分離后離心機(jī)3 000 r/min離心10 min，小心吸取上清液裝于EP管中，置于-20 ℃低溫冰箱中保存待檢。
血清生化指標(biāo)：總蛋白(TP)、總膽固醇（TC）、尿素（UREA）、堿性磷酸酶（AKP）、白蛋白（ALB）；血清免疫指標(biāo)：免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白A（IgA）和免疫球蛋白M（IgM）；血清抗氧化指標(biāo)：總超氧化物歧化酶（T-SOD）、總抗氧化能力（T-AOC）、丙二醛（MDA）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）。以上指標(biāo)均采用試劑盒測定，試劑盒購于南京建成生物工程研究所，操作按說明書進(jìn)行。
1.4.4 腸道黏膜形態(tài)的測定
試驗(yàn)仔豬在試驗(yàn)進(jìn)行第29 d早上屠宰采樣，分別從A、B、C、D組每個重復(fù)選擇1頭接近該組平均體重的試驗(yàn)仔豬，屠宰后取出腸道。
取十二指腸、空腸、回腸組織樣品用石蠟包埋，制作石蠟切片，HE染色后觀測腸道組織形態(tài)。切片置于光學(xué)顯微鏡下，并挑選典型視野拍攝成圖片，用YLE-21DY顯微成像系統(tǒng)的自帶圖像分析軟件IMAGEEX進(jìn)行觀察測量腸絨毛高度、隱窩深度，并計(jì)算絨毛高度/隱窩深度（V/C）值。
1.4.5 腸道上皮緊密連接蛋白mRNA相對表達(dá)量的測定
以ACTB（β-actin）為內(nèi)參，利用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)對回腸、空腸、十二指腸黏膜咬合蛋白（OCLN）、封閉蛋白-5（CLDN5）和緊密連接蛋白1(TJP1)進(jìn)行實(shí)時熒光定量分析。用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物相關(guān)引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列見表2。
采用RNAiso Plus試劑盒提取回腸、空腸、十二指腸黏膜組織RNA，按照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｃ總€樣品做3個重復(fù)，按照反應(yīng)程序：95 ℃、7 s；95 ℃、5 s；60 ℃、30 s，循環(huán)40次熒光定量PCR。OCLN、CLDN5和TJP1的基因相對表達(dá)量用2-??Ct法[7]計(jì)算。
1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析
試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，SPSS21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，Duncan's法進(jìn)行多重比較，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.05為差異顯著，0.05≤P<0.1為有顯著性趨勢。
由表3可知，C、D組的平均日增重、平均日采食量均高于A、B組(P>0.05)；C、D組的料重比均低于A組(P>0.05)；B、C、D組的腹瀉指數(shù)顯著低于A組(P<0.05)，且C、D組相對于B組還有降低趨勢。
由表4可知，D組的血清總蛋白含量高于A、C組(P>0.05)，顯著高于B組(P<0.05)；A、C、D組的白蛋白含量無顯著差異(P>0.05)，但均顯著高于B組(P<0.05)；B、C、D組的總膽固醇低于A組，且C組最低；尿素方面各組間無顯著差異(P>0.05)；B、C、D組的堿性磷酸酶活性顯著高于A組(P<0.05)，且D組最高。
由表5可知，各組在血清的免疫蛋白A、免疫蛋白G、免疫蛋白M的含量均無顯著差異(P>0.05)。D組的總抗氧化能力顯著高于A、C組(P<0.05)；各組之間谷胱甘肽過氧化物酶活性和丙二醛的含量無顯著差異(P>0.05)。B組的總超氧化物歧化酶（T-SOD）活性顯著高于A組(P<0.05)，其余各組之間差異不顯著(P>0.05)；C、D組的過氧化氫酶活性顯著高于A、B組(P<0.05)，并且D組高于C組(P>0.05)。
由表6可知，十二指腸方面，C、D組的絨毛高度顯著高于A組(P<0.05)；C組的隱窩深度顯著低于A、B組(P<0.05)；C、D組的V/C均顯著高于A、B組(P<0.05)。空腸方面，C、D組的絨毛高度顯著高于A、B組(P<0.05)；C、D組的V/C均顯著高于A、B組(P<0.05)，且C組顯著高于D組(P<0.05)。回腸方面，C、D組的絨毛高度顯著高于A、B組；C組的V/C顯著高于A組(P<0.05)，D組的V/C均顯著高于A、B組(P<0.05)。
由圖1可以看出，在十二指腸階段中，D組的OCLN基因表達(dá)量顯著高于A、B、C組(P<0.05)；D組的CLDN5基因表達(dá)量高于B組(P<0.05)；C、D組的TJP1基因的表達(dá)量顯著高于A組(P<0.05)。由圖2可以看出，在空腸階段中，OCLN、CLDN5、TJP1基因在各組的表達(dá)量無顯著差異。由圖3可以看出，在回腸階段中，OCLN、TJP1基因在各組仔豬的回腸中表達(dá)量無顯著差異(P>0.05)；CLDN5基因在D組回腸中的表達(dá)量顯著高于A、B組(P<0.05)，CLDN5基因在C組回腸中的表達(dá)量顯著高于A組(P<0.05)。
植物精油作為植物提取物的一種，直到近些年才開始發(fā)現(xiàn)其促生長效果[8]。目前許多研究都已表明，植物精油能夠顯著提高動物的生長性能。Ariza等（2005）[9]研究發(fā)現(xiàn)，在日糧中添加植物精油添加劑對提高斷奶仔豬的日采食量和日增重的效果與抗生素相似。Franz等（2010）[10]研究報道，飼糧中添加植物精油能提高飼料轉(zhuǎn)化率3%，改善豬體增重2%。陳如水等（2014）[11]研究表明，在日糧中添加植物精油和發(fā)酵豆粕復(fù)合物，能使仔豬日增重提高19.51%，日采食量提高6.84%，同時降低腹瀉率和料肉比。周明等（2016）[12]研究了肉桂醛替代斷奶仔豬飼糧中金霉素和桿菌肽鋅的影響，結(jié)果顯示日糧中添加600 mg/kg的肉桂醛能夠顯著降低腹瀉率和腹瀉指數(shù)。李方方等（2019）[13]提出，飼糧中添加植物精油顯著提高了動物的生長性能，促進(jìn)了斷奶仔豬對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。本試驗(yàn)的結(jié)果表明，飼糧中添加400 mg/kg復(fù)合植物精油Ⅰ、Ⅱ均可以提高仔豬的平均日增重、平均日采食量，降低料重比，復(fù)合植物精油Ⅱ顯著降低腹瀉指數(shù)，研究結(jié)果與上述研究報道基本一致。
3.2 復(fù)合植物精油對仔豬血清生化指標(biāo)的影響
動物機(jī)體的新陳代謝及健康狀況在一定程度上反映在血清生化指標(biāo)的變化上，血清總蛋白主要構(gòu)成為白蛋白和球蛋白，與機(jī)體蛋白質(zhì)的吸收和代謝有著密切的聯(lián)系。方熱軍等（2010）[14]研究報道，添加不同劑量的植物精油提取物后，斷奶仔豬的血清總蛋白含量均比對照組高。劉猛（2011）[15]研究得出，飼糧中添加0.015%植物精油極顯著提高仔豬血液中的總蛋白和白蛋白含量。宋軍帥等（2019）[16]結(jié)果表明，飼糧中添加150 mg/kg復(fù)合植物精油能顯著提高仔豬血清白蛋白含量。這些報道和本研究中添加復(fù)合植物精油組的血清總蛋白、白蛋白含量均高于A、B組的結(jié)果比較相似。周選武等（2017）[6]報道，在仔豬飼糧添加100、200 mg/kg復(fù)合精油，斷奶仔豬的血清總膽固醇含量呈下降趨勢，但血清中的尿素含量未產(chǎn)生顯著變化。這與本研究的結(jié)果添加復(fù)合精油組的總膽固醇含量均低于對照組，并且各組的尿素含量沒有顯著變化基本一致。試驗(yàn)結(jié)果表明，飼糧中添加400 mg/kg復(fù)合植物精油Ⅰ、Ⅱ均能提高堿性磷酸酶的活性，降低總膽固醇含量，對機(jī)體尿素含量影響不大，但有降低趨勢，還需要進(jìn)一步研究證實(shí)。
3.3 復(fù)合植物精油對斷奶仔豬血清免疫球蛋白含量、抗氧化指標(biāo)的影響
動物機(jī)體通過自身的體液免疫和細(xì)胞免疫來維持健康。周洋等（2018）[17]報道，植物精油中活性成分通過調(diào)節(jié)體內(nèi)抗氧化酶活性，降低細(xì)胞促炎因子的含量，從而提高動物機(jī)體免疫力。張強(qiáng)等（2012）[18]在動物營養(yǎng)學(xué)術(shù)研討會提出，飼糧中添加0.025%的復(fù)合植物精油，能夠有效提高仔豬血清中免疫球蛋白A、免疫蛋白G以及白細(xì)胞介素-6等免疫蛋白的分泌，但對免疫蛋白G的含量沒有顯著影響。而本研究中添加復(fù)合植物精油Ⅰ、Ⅱ?qū)ψ胸i的免疫球蛋白A、G、M沒有顯著變化，因此，復(fù)合植物精油對仔豬的免疫力的影響及其調(diào)節(jié)機(jī)理還需要進(jìn)一步研究論證。
研究發(fā)現(xiàn)植物精油的酯類、酚類、醛類、醇類等主要性成分通過作用于自由基，抑制或阻止動物機(jī)體自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的發(fā)生，使其活性降低，從而達(dá)到清除自由基，緩解動物機(jī)體氧化應(yīng)激[19]。方熱軍等（2010）[14]研究提出，日糧中添加植物精油提取物能顯著提高斷奶仔豬血清中谷胱甘肽過氧化物酶與超氧化物歧化酶的活力，提高抗氧化功能。Hashemipour等（2013）[20]研究表明，日糧中添加百里香酚能提高肉雞血清中的超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶的活性。方秋紅等（2014）[21]研究報道，飼糧中添加50 mg/kg的肉桂油能提高斷奶仔豬血液中的谷胱甘肽過氧化物酶的活性。Xu等（2018）[22]研究報道，斷奶仔豬飼糧中添加復(fù)合植物精油，在顯著提高仔豬生長性能的同時還能顯著提高血清總超氧化物歧化酶活性，提高抗氧化能力。通過本研究的結(jié)果可以看出，D組的抗氧化功能優(yōu)勢比較明顯，這與張玲玲[23]、宋軍帥[16]、張強(qiáng)[18]等研究論述也是一致的。試驗(yàn)結(jié)果表明，飼糧中添加400 mg/kg復(fù)合植物精油Ⅰ、Ⅱ能緩解斷奶仔豬氧化應(yīng)激，提高機(jī)體抗氧化能力，增強(qiáng)斷奶仔豬的機(jī)體健康，其中復(fù)合植物精油Ⅱ在提高總抗氧化能力和過氧化氫酶活性方面表現(xiàn)顯著。
3.4 復(fù)合植物精油對仔豬腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響
腸道既是動物體消化吸收主要的器官，又是機(jī)體有效抵抗內(nèi)/外源性細(xì)菌、病毒及其他有毒有害物質(zhì)的屏障，因此腸道結(jié)構(gòu)受損傷，動物生長性能就會下降[24-25]。絨毛高度、隱窩深度及絨毛高度/隱窩深度是衡量腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)及完整性的重要指標(biāo)。王亞男（2017）[26]研究表明，日糧中添加包被植物精油代替硫酸黏桿菌素能顯著提高仔豬絨毛高度。這與本試驗(yàn)中的添加復(fù)合植物精油C、D組的十二指腸、空腸、回腸的絨毛高度高于基礎(chǔ)A組和抗生素B組的結(jié)果是一致的。扶雄鋒等（2016）[27]報道，與對照組相比，飼糧中添加植物精油能夠顯著提高十二指腸、空腸和回腸絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度的比值。宋轉(zhuǎn)等（2019）[28]研究報道，日糧中添加復(fù)合植物精油能提高仔豬空腸、回腸的絨毛高度及絨毛高度/隱窩深度的比值，緩解仔豬腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的損傷。這與本試驗(yàn)日糧中添加復(fù)合植物精油Ⅰ、Ⅱ后，各小腸腸段的絨隱比相較于基礎(chǔ)A組和抗生素B組均有不同程度的升高結(jié)論是一致的，這說明飼糧中添加400 mg/kg復(fù)合植物精油Ⅰ、Ⅱ均可以促進(jìn)腸道絨毛的生長，提高絨隱比，增加腸道消化吸收面積，緩解仔豬腸道損傷，促進(jìn)腸道損傷后修復(fù)。
3.5 復(fù)合植物精油對斷奶仔豬腸道緊密連接蛋白基因mRNA表達(dá)的影響
緊密連接蛋白基因的表達(dá)量直接影響緊密連接蛋白的表達(dá)與分布，因此緊密連接蛋白基因的表達(dá)量是衡量腸上皮屏障功能的重要指標(biāo)[29]。本試驗(yàn)研究結(jié)果顯示，添加復(fù)合植物精油能夠提高OCLN、CLDN5、TJP1基因在十二指腸和回腸段的表達(dá)量，這也進(jìn)一步從分子水平上說明復(fù)合植物精油可以促進(jìn)仔豬腸道健康，維護(hù)腸道穩(wěn)態(tài)。但在分子水平上研究植物精油的報道還未見到報道，需要進(jìn)一步研究與之論證。
綜上所述：①飼糧中添加400 mg/kg復(fù)合植物精油可改善早期斷奶仔豬的生長性能，在提高平均日增重的同時提高機(jī)體免疫力，緩解氧化應(yīng)激損傷。②飼糧中添加400 mg/kg復(fù)合植物精油Ⅱ顯著促進(jìn)了腸道絨毛的生長，提高絨毛高度與隱窩深度的比值，提高緊密連接蛋白基因的表達(dá)量，緩解仔豬腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的損傷。③綜合對比復(fù)合植物精油Ⅰ和Ⅱ的試驗(yàn)結(jié)果，復(fù)合植物精油Ⅱ效果更佳。
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