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畜牧人

標(biāo)題: 植物蘇云金芽孢桿菌蛋白(BT)酶聯(lián)免疫分析 [打印本頁(yè)]

作者: kiroco 時(shí)間: 2014-2-20 15:53
標(biāo)題: 植物蘇云金芽孢桿菌蛋白(BT)酶聯(lián)免疫分析
本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中植物蘇云金芽孢桿菌蛋白(BT)水平.用純化的植物蘇云金芽孢桿菌蛋白(BT)抗體包被微孔板,制成固相抗體,往包被單抗的微孔中依次加入蘇云金芽孢桿菌蛋白(BT),再與HRP標(biāo)記的蘇云金芽孢桿菌蛋白(BT)抗體結(jié)合,形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物,經(jīng)過(guò)徹底洗滌后加底物TMB顯色.TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色.顏色的深淺和樣品中的蘇云金芽孢桿菌蛋白(BT)呈正相關(guān).用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD值),通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中植物蘇云金芽孢桿菌蛋白(BT)濃度.
試劑盒組成:
試劑盒組成
48孔配置
96孔配置
保存
說(shuō)明書(shū)
1份
1份
封板膜
2片(48)
2片(96)
密封袋
1個(gè)
1個(gè)
酶標(biāo)包被板
1×48
1×96
2-8℃保存
標(biāo)準(zhǔn)品:900ng/g
0.5ml×1瓶
0.5ml×1瓶
2-8℃保存
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
1.5ml×1瓶
1.5ml×1瓶
2-8℃保存
酶標(biāo)試劑
3 ml×1瓶
6 ml×1瓶
2-8℃保存
樣品稀釋液
3 ml×1瓶
6 ml×1瓶
2-8℃保存
顯色劑A液
3 ml×1瓶
6 ml×1瓶
2-8℃保存
顯色劑B液
3 ml×1瓶
6 ml×1瓶
2-8℃保存
終止液
3ml×1瓶
6ml×1瓶
2-8℃保存
濃縮洗滌液
(20ml×20倍)×1瓶
(20ml×30倍)×1瓶
2-8℃保存
樣本處理及要求:
1. 血清:室溫血液自然凝固10-20分鐘,離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分).仔細(xì)收集上清,保存過(guò)程中如出現(xiàn)沉淀,應(yīng)再次離心.
2. 血漿:應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑,混合10-20分鐘后,離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分).仔細(xì)收集上清,保存過(guò)程中如有沉淀形成,應(yīng)該再次離心.
3. 尿液:用無(wú)菌管收集,離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分).仔細(xì)收集上清,保存過(guò)程中如有沉淀形成,應(yīng)再次離心.胸腹水,腦脊液參照實(shí)行.
4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清:檢測(cè)分泌性的成份時(shí),用無(wú)菌管收集.離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分).仔細(xì)收集上清.檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí),用PBS(PH7.2-7.4)稀釋細(xì)胞懸液,細(xì)胞濃度達(dá)到100萬(wàn)/ml左右.通過(guò)反復(fù)凍融,以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份.離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分).仔細(xì)收集上清.保存過(guò)程中如有沉淀形成,應(yīng)再次離心.
5. 組織標(biāo)本:切割標(biāo)本后,稱取重量.加入一定量的PBS,PH7.4.用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?標(biāo)本融化后仍然保持2-8℃的溫度.加入一定量的PBS(PH7.4),用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分.離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分).仔細(xì)收集上清.分裝后一份待檢測(cè),其余冷凍備用.
6. 標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取,提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行,提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn).若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn),可將標(biāo)本放于-20℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融.
7. 不能檢測(cè)含NaN3的樣品,因NaN3抑制辣根過(guò)氧化物酶的(HRP)活性.
操作步驟:
標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣:在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔10孔,在第一,第二孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品100μl,然后在第一,第二孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl,混勻;然后從第一孔,第二孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔,再在第三,第四孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl,混勻;然后在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉,再各取50μl分別加到第五,第六孔中,再在第五,第六孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50ul,混勻;混勻后從第五,第六孔中各取50μl分別加到第七,第八孔中,再在第七,第八孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl,混勻后從第七,第八孔中分別取50μl加到第九,第十孔中,再在第九第十孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl,混勻后從第九第十孔中各取50μl棄掉.(稀釋后各孔加樣量都為50μl,濃度分別為600 ng/g,400 ng/g ,200 ng/g,100ng/g, 50 ng/g).
加樣:分別設(shè)空白孔(空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑,其余各步操作相同),待測(cè)樣品孔.在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,然后再加待測(cè)樣品10μl(樣品最終稀釋度為5倍).加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動(dòng)混勻.
溫育:用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘.
配液:將30(48T的20倍)倍濃縮洗滌液用蒸餾水30(48T的20倍)倍稀釋后備用.
洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30秒后棄去,如此重復(fù)5次,拍干.
加酶:每孔加入酶標(biāo)試劑50μl,空白孔除外.
溫育:操作同3.
洗滌:操作同5.
顯色:每孔先加入顯色劑A50μl,再加入顯色劑B50μl,輕輕震蕩混勻,37℃避光顯色15分鐘.
終止:每孔加終止液50μl,終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色).
測(cè)定:以空白空調(diào)零,450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度(OD值). 測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行.
注意事項(xiàng):
試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用,酶標(biāo)包被板開(kāi)封后如未用完,板條應(yīng)裝入密封袋中保存.
濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出,稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶,洗滌時(shí)不影響結(jié)果.
各步加樣均應(yīng)使用加樣器,并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性,以避免試驗(yàn)誤差.一次加樣時(shí)間最好控制在5分鐘內(nèi),如標(biāo)本數(shù)量多,推薦使用排槍加樣.
請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線,最好做復(fù)孔.如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過(guò)高(樣本OD值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔第一孔的OD值),請(qǐng)先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)(n倍)后再測(cè)定,計(jì)算時(shí)請(qǐng)最后乘以總稀釋倍數(shù)(×n×5).
封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染.
底物請(qǐng)避光保存.
嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)的操作進(jìn)行,試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).
所有樣品,洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理.
本試劑不同批號(hào)組分不得混用.
10. 如與英文說(shuō)明書(shū)有異,以英文說(shuō)明書(shū)為準(zhǔn).
計(jì)算:
以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo),OD值為縱坐標(biāo),
在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)樣品的OD
值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度;再乘以稀釋
倍數(shù);或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)
準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式,將樣品的OD值
代入方程式,計(jì)算出樣品濃度,再乘以稀釋
倍數(shù),即為樣品的實(shí)際濃度.
試劑盒性能:
1.樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.95以上.
2.批內(nèi)與批見(jiàn)應(yīng)分別小于9%和11%
檢測(cè)范圍:
30ng/g-800ng/g

作者: kiroco 時(shí)間: 2014-2-20 15:55
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