枯草芽孢桿菌發酵棉粕營養特性的研究

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　　導讀

　　隨著畜牧業生產和飼料工業的發展，一些常規飼料，尤其是蛋白質飼料嚴重缺乏，越來越滿足不了生產的需要。尋求非常規蛋白質飼料對我國畜牧業的發展起著非常重要的作用。而我國是產棉大國，棉籽產量居世界首位，而且棉籽經過加工榨油后的副產物棉籽餅粕是很好的蛋白質飼料。但是普通的棉籽餅粕具有抗營養因子和棉酚，使得棉籽餅粕不能大量使用。枯草芽孢桿菌生長速度快，營養需求簡單，易于存活、定殖和繁殖，并且分泌多種酶和維生素，具有良好的發酵作用，因此利用微生物對棉粕進行生物發酵，消除抗營養因子，降低棉酚含量，提高棉粕的消化利用率具有重要意義。鮑振國等(2013)及和小黑等(2014)通過研究枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌和熱帶假絲酵母發酵棉粕，發現棉粕經過微生物發酵后均能不同程度地分泌各種酶類，降解粗纖維，提高粗蛋白含量，而且將蛋白降解為易于機體吸收的小肽，并能降解抗營養因子植酸等。因此試驗擬通過枯草芽孢桿菌對棉粕進行發酵，探究其發酵前后棉酚、常規營養物質、小肽和氨基酸的含量的變化，為發酵棉粕的營養價值評定提供理論依據。

　　1材料與方法

　　1.1 試驗樣品
　　發酵底料由90%的棉粕和10%的玉米組成，采用枯草芽孢桿菌菌種為Z3，由新疆石河子大學動物營養實驗室選育。

　　1.2 營養瓊脂培養基
　　蛋白胨10、牛肉膏3、NaCl 5和瓊脂15g/L，pH 7.0，121℃條件下高壓15min。

　　1.3 種子液培養
　　將枯草芽孢桿菌Z3挑取1環菌苔接入營養瓊脂培養基，37℃培養24h后接入20mL(50mL三角瓶)營養肉湯培養基，37℃，200r/min搖動培養15h(一級菌種)，取一級菌種1mL接入50mL(150mL三角瓶)營養肉湯培養基，37℃，200r/min搖動培養15h(二級菌種)。

　　1.4 試驗方法
　　1.4.1 發酵底物處理
　　試驗組底物處理:將棉粕90和玉米粉l0g加入500mL三角瓶中混合均勻，然后加入蒸餾水30mL，充分攪拌，在0.056MPa，121℃條件下蒸汽滅菌20min，冷卻后于無菌條件下接入枯草芽抱桿菌Z3二級種子液7mL，攪拌均勻，三角瓶4層紗布封口，于恒溫培養箱37℃靜止培養72h。發酵結束后，將發酵產物放入烘箱中45℃烘干48h，冷卻粉碎，過60目篩，裝入樣品袋，保存于4℃冰箱中待測。

　　對照組底物處理:將棉粕90和玉米粉10g加入500mL三角瓶中混合均勻，然后加入蒸餾水30mL，充分攪拌調濕，在0.056MPa，121℃條件下蒸汽滅菌20min，冷卻后接入液體培養基(不含菌種)7mL，攪拌均勻，不經發酵，直接將其放入烘箱中，45℃烘干48h，冷卻粉碎，過60目篩，裝入樣品袋，保存于4℃冰箱中待測。

　　1.4.2 棉酚含量的測定
　　總棉酚(TG)采用ISO6866—1985方法測定，游離棉酚(FG)采用GB13086—1991方法測定，結合棉酚(BG)按照BG=TG－FG計算得出。游離棉酚脫毒率/%=(發酵前底物FG單位含量－發酵后底物FG校正含量)÷發酵前底物FG單位含量×100。常規營養指標的測定采用國標法(GB6435)。

　　1.4.3 小肽含量的測定
　　分別稱取樣品1g溶于8mL蒸溜水，在25℃空氣浴搖床振蕩提取2h，混合液離心4000r/min20min，取上清液，過0.45μm微孔濾膜，4℃保存待測，采用高效液相色譜進行分析。色譜柱:型號TSKgelG2000SWXL，8mm×300min凝膠柱。流動相(體積比)∶水∶三氟乙酸為100%∶0.1%。檢測波長:220nm。流速:1.0mL/min，柱溫:30℃，進樣體積:20μL。

　　以Gly－Leu(相對分子質量188u)、還原型谷耽甘肽(GSH，相對分子質量307u)、氧化型谷胱甘肽(GSSG，相對分子質量613u)和桿菌肽(相對分子質量1423u)作為相對分子質量標準建立保留時間與分子量的線性方程，經計算確定600、1000和1800u相對分子質量的保留時間。將樣品在以上色譜條件下分析，選擇這段時間內的峰，積分求得峰面積，相對分子質量大的先出峰，相對分子質量小的后出峰。

　　1.4.4 氨基酸含量的測定
　　樣品粉末用甲醇水溶液(甲醇∶水=1∶1)充分提取，提取質量濃度為40mg/mL，提取液過0.45μm水系濾膜，濾液進行氨基酸前處理操作。

　　取10μL稀釋液，置于試管內，加100μL日常工作液，渦旋混勻，高速離心。上清液轉入另一試管，氮吹。加入60μL衍生工作液，渦旋混勻，旋轉離心。65℃溫育15min，然后離心氮吹。加入100μL乙腈水混合液復溶，渦旋混勻，旋轉離心。使用液質聯用質譜儀檢測樣本。

　　液相和質譜儀器型號:液相型號，HPLC Ultimate3000;質譜型號，3200 Q TRAPLC－MS/MS;色譜柱，AAA C 18，5μm，150mm×4.6mm，柱溫50℃，進樣量10μL;流動相A，水+0.1%甲酸;流動相B，乙腈+0.1%甲酸;CUR，20.00;CAD，Me－dium;CXP，5.00;IS，5500.00;DP，35.0;GS1，55.00;TEM，580.00;EP，10.0;GS2，60.00。

　　2結果與分析

　　2.1 枯草芽孢桿菌發酵棉粕對棉酚含量的影響

　　從表2可見:底物滅菌對照組相對于底物不滅菌對照組總棉酚、游離棉酚和結合棉酚含量顯著降低(P＜0.05)，分別降低2146.67、536.83和1609.84mg/kg。發酵組和底物滅菌對照組相比，其總棉酚、游離棉酚和結合棉酚含量顯著降低(P＜0.05)，分別降低531.67、101.00和430.66mg/kg。棉粕底物經過滅菌后脫毒率為74.77%，而經過滅菌后再發酵，脫毒率進一步顯著提高，脫毒率為88.84%，由以上分析可以得出，底物經過滅菌和滅菌后發酵可以使大部分游離棉酚降解消除，部分結合棉酚和總棉酚也被降解。

　　2.2 枯草芽孢桿菌發酵棉粕對常規營養成分的影響

　　從表3可見:底物不滅菌對照組、底物滅菌對照組和發酵組3組間的干物質差異不顯著(P＞0.05);底物滅菌對照組和底物不滅菌對照組相比，粗蛋白、粗脂肪、酸性洗滌纖維(ADF)、中性洗滌纖維(NDF)、鈣、磷和粗灰分含量差異不顯著(P＞0.05);發酵組與底物不滅菌對照組和底物滅菌對照組相比，粗蛋白含量顯著增加(P＜0.05)，蛋白含量分別增加14.37%和13.79%，粗脂肪、ADF和NDF含量顯著降低(P＜0.05)，磷和鈣含量顯著增加(P＜0.05)。底物經過滅菌后其常規營養成分含量基本不變，但是經過發酵后，其常規營養成分含量會有所變化，其中粗蛋白含量增加0.51%，其余常規營養成分含量下降。

　　2.3 枯草芽孢桿菌發酵棉粕對小肽含量的影響

　　從表4可見:底物不滅菌對照組和底物滅菌對照組小肽含量差異不顯著(P＞0.05);發酵組棉粕中的小肽含量均高于未發酵的棉粕，且差異顯著(P＜0.05)，其中小于600、600～1000和1000～1800u的小肽含量分別提高到12.40%、1.45%和1.79%。底物高壓對小肽含量的產生影響不大，而經過發酵后小肽含量會明顯的增加。

　　2.3 枯草芽孢桿菌發酵棉粕對小肽含量的影響

　　從表4可見:底物不滅菌對照組和底物滅菌對照組小肽含量差異不顯著(P＞0.05);發酵組棉粕中的小肽含量均高于未發酵的棉粕，且差異顯著(P＜0.05)，其中小于600、600～1000和1000～1800u的小肽含量分別提高到12.40%、1.45%和1.79%。底物高壓對小肽含量的產生影響不大，而經過發酵后小肽含量會明顯的增加。

　　3討 論

　　利用微生物發酵棉粕，不僅可以降低棉粕中的棉酚含量，還可以提高棉粕的營養價值，改善棉粕源飼料蛋白質品質，同時可以產生多種消化酶使大分子物質分解為小肽物質及提高發酵產物的菌群數量，對提高棉粕源飼料的綜合利用價值具有重要意義。

　　3.1 枯草芽孢桿菌發酵棉粕對底物中棉酚含量和常規營養物質的影響

　　試驗底物經過滅菌和滅菌后發酵都可以降低棉粕中棉酚的含量，說明高壓滅菌可以破壞棉酚的結構，導致部分棉酚結構不完整，從而起到使棉酚含量降低的作用。高壓滅菌的底物經過發酵后，可以顯著的降低棉酚的含量，說明通過枯草芽孢桿菌發酵，能夠達到降低棉粕棉酚含量的目的，這與賈曉鋒等(2009)和魏二虹等(2010)利用生物發酵的研究結果相一致。張慶華等(2007)采用熱帶假絲酵母、擬內胞霉和植物乳桿菌協同固態發酵棉粕，顯著的提高棉粕脫毒率和粗蛋白含量。吳偉偉等(2010)用黑曲霉與釀酒酵母混合固態發酵棉籽餅粕得到了同樣的結果。研究發現，經過枯草芽孢桿菌發酵后，其蛋白水平會有一定的提高，可能主要與微生物的生長及菌體蛋白含量的增加和微生物發酵過程中分泌的酶含量的增加有關。同時枯草芽孢桿菌利用底物中的非蛋白氮將其轉化為菌體蛋白或分泌蛋白，使發酵后蛋白含量提高。研究發現，使用熱帶假絲酵母和黑曲霉復合發酵棉粕顯著提高粗蛋白含量的同時提高棉粕鈣和磷的含量，降低粗脂肪、粗纖維和粗灰分含量，這與研究的結果一致。這主要是由于微生物生長代謝過程中，氧化消耗能量，使能量物質減少，因此鈣和磷在干物質中的比例就相對提高，而且微生物能夠利用并且分解纖維素、半纖維素和木質素，將其轉化為寡糖，使粗纖維含量降低。

　　3.2 枯草芽孢桿菌發酵棉粕對底物中小肽和氨基酸含量的影響

　　研究利用枯草芽孢桿菌發酵棉粕底物，發現經過發酵后小肽的含量和氨基酸的含量顯著提高，許多研究表明微生物發酵可將底物中蛋白質降解為小分子蛋白和氨基酸等，顯著提高飼料中氨基酸的含量。使用熱帶假絲酵母JD－9和干酪乳桿菌MX－48發酵棉粕，發酵后棉粕中小肽含量顯著的提高。可能是利用微生物發酵使得很多難利用的大分子物質被降解，產生了很多易于被吸收的小分子物質、小肽類物質和游離氨基酸，顯著提高飼料的營養價值。

　　4結 論

　　枯草芽孢桿菌發酵棉粕能很大程度的降低游離棉酚的含量，降低率達到88.84%。同時經過發酵后蛋白質含量顯著提高5.2%，顯著的降低粗脂肪和粗纖維的含量。增加底物中肽類物質的含量，相對分子質量小于600、600～1000和1000～1800u小肽含量分別提高12.4%、1.45%和1.793%，而且必需氨基酸蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和賴氨酸分別提高8.45%、6.25%、24.1%、3.5%、12.3%和9.52%。

　　注：本文由生物飼料開發國家工程研究中心（BFC）小編整理發布，如有任何建議或意見及投稿等，請您加小編微信（13260429991）交流互動。

　　參考文獻略
　　責編：馬維軍；審閱：陳達 博士
　　來源：飼料研究；作者：孫煥林，孫新文，李洪，張文舉