枯草芽孢桿菌對產氣莢膜梭菌攻毒肉雞生長性能和腸道健康的影響

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　　摘要: 本試驗旨在研究飼糧中添加枯草芽孢桿菌對產氣莢膜梭菌攻毒肉雞生長性能和腸道健康的影響。選用480只1日齡肉公雞（Ross 308）隨機分為5組，分別為對照組（CON組）、產氣莢膜梭菌攻毒組（CP組）、CP+10 mg/kg恩拉霉素組（ENRA組），CP+10 mg/kg枯草芽孢桿菌（1010 CFU/g）組（BS組）和CP+5 mg/kg恩拉霉素+10 mg/kg枯草芽孢桿菌組（ENRA+BS組），每組8個重復，每個重復12只，試驗期42 d。所有攻毒組肉雞在第14天時口服混合型艾美爾球蟲懸浮液[11 000孢子/（mL·只）]，第16~18天時口服產氣莢膜梭菌懸浮液[108 CFU/（mL·只）]。結果表明：1）與CP組相比，ENRA組、BS組和ENRA+BS組肉雞第1~21天料重比有降低的趨勢（P=0.051）；與CON組相比，ENRA組和ENRA+BS組肉雞第1~42天料重比顯著降低（P < 0.05）。2）與CP組相比，ENRA組、BS組和ENRA+BS組肉雞第28天空腸病變計分極顯著降低（P < 0.01）。3）第21天和第42天時，ENRA組隱窩深度極顯著低于CP組、BS組和ENRA+BS組（P < 0.01）。第42天時，與CP組相比，ENRA組絨毛高度/隱窩深度（VH/CD）顯著增加（P < 0.05），BS組和ENRA+BS組VH/CD有提高趨勢（P > 0.05）。4）第21天時，與CP組相比，ENRA+BS組空腸黏膜分泌型免疫球蛋白A（SIgA）含量顯著增加（P < 0.05）；第28天時，與CP組相比，BS組和ENRA+BS組空腸黏膜免疫球蛋白G（IgG）含量顯著增加（P < 0.05）。5）與CP組相比，ENRA組、BS組和ENRA+BS組第21天肉雞大腸桿菌數量極顯著降低（P < 0.01）；ENRA組、BS組和ENRA+BS組第28天肉雞產氣莢膜梭菌數量極顯著降低（P < 0.01）。由此得出，枯草芽孢桿菌可在一定程度上改善肉雞腸道健康和生長性能，當與恩拉霉素（5 mg/kg）合用時，其效果更好，從而起到減少抗生素使用的作用。

　　關鍵詞: 枯草芽孢桿菌    產氣莢膜梭菌    肉雞    生長性能    腸道健康    球蟲

　　壞死性腸炎(necrotic enteritis，NE)是家禽常見病，會影響家禽生長性能，造成嚴重的經濟損失。據統計，在全球范圍內，由NE造成的經濟損失約20億美元/年[1]。產氣莢膜梭菌是一種厭氧性革蘭氏陽性芽孢桿菌，是造成家禽NE的主要病原菌。目前，防治NE的主要措施是在飼糧中添加桿菌肽鋅等抗生素，在飼糧中添加恩拉霉素可抑制腸道產氣莢膜梭菌[2]。隨著越來越多國家限制使用抗生素，家禽養殖業中若爆發NE，會給食品安全和動物福利帶來更大的危害。枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)是一種綠色、無污染的好氧性益生菌，耐壓、抗酸堿，通過胃酸后進入腸道，腸道內能以孢子形式迅速萌芽繁殖，消耗掉腸道內的氧，抑制有害菌，促進有益菌的增殖，改善飼料效率和腸道黏膜結構，對防治疾病、促進動物生長有積極作用。研究表明，健康的雞胃腸道中產氣莢膜梭菌數量較少，患NE雞產氣莢膜梭菌數量相對較多[3]，添加枯草芽孢桿菌可顯著降低雞群產氣莢膜梭菌的感染程度[4]。本研究旨在研究枯草芽孢桿菌對產氣莢膜梭菌攻毒肉雞生長性能和腸道健康的影響，旨在為NE疾病的防治和抗生素的替代品研究提供理論依據。

　　1 材料與方法
　　1.1 試驗材料

　　恩拉霉素購自先靈葆雅(上海)貿易有限公司，雞球蟲病四價活疫苗(柔嫩艾美爾球蟲PTM株+毒害艾美爾球蟲PNHZ株+巨型艾美耳球蟲PMHY株+堆型艾美爾球蟲PAHY株)由佛山市正典生物技術有限公司提供，每羽份含有1 100孢子囊。產氣莢膜梭菌購自中國獸醫微生物菌種保藏中心，菌種編號CVCC2017 type A，按照Forder等[5]試驗中所提到的方法培養，細菌濃度為1×108 CFU/mL。枯草芽孢桿菌(B.subtilis DSM29784)由安迪蘇(中國，上海)提供，含菌量為1×1010 CFU/g。

　　1.2 試驗設計

　　采用單因子隨機分組設計，選用480只1日齡健康的肉公雞(Ross 308)隨機分為5組，分別為對照組(CON組)、產氣莢膜梭菌攻毒組(CP組)、CP+10 mg/kg恩拉霉素組(ENRA組)，CP+10 mg/kg枯草芽孢桿菌(1010 CFU/g)組(BS組)和CP+5 mg/kg恩拉霉素+10 mg/kg枯草芽孢桿菌組(ENRA+BS組)，每組8個重復，每個重復12只雞，試驗期42 d，分2個階段：第1~21天為前期，第22~42天為后期。在試驗第14天，攻毒肉雞灌喂10倍免疫劑量的混合型艾美爾球蟲懸浮液[11 000孢子/(mL·只)]，對照組灌喂相同劑量的生理鹽水；第16~18天，攻毒肉雞每日灌喂產氣莢膜梭菌懸浮液[108CFU/(mL·只)]，連續灌喂3 d，對照組灌喂相同劑量的培養液。

　　1.3 試驗飼糧

　　試驗飼糧為玉米-豆粕型基礎飼糧，參照《雞的飼養標準》 (NY/T 33—2004)并結合課題組前期研究結果配制[6], 其組成及營養水平見表 1。試驗飼糧制成顆粒料形式飼喂。

　　1.4 試驗管理

　　試驗在四川農業大學動物營養研究所試驗場進行。試驗肉雞均網上平養(高0.5 m×寬1.0 m×長1.0 m)，雛雞前3天圈舍溫度33 ℃，第4~7天逐漸降低至32~30 ℃，之后每周降低2 ℃，直到保持在22~24 ℃至試驗結束。肉雞采用連續光照、自然通風、自由采食和充足飲水，按正常免疫程序接種。

　　1.5 指標測定
　　1.5.1 生長性能

　　試驗期內觀察試驗雞生長和健康狀況，以重復為單位，記錄耗料量，并于試驗期第21、28和42天時，提前12 h斷料，計算各組試驗雞的階段體增重(BWG)、料重比(F/G)和階段采食量(FI)。

　　1.5.2 腸道形態

　　分別于試驗期第21、28和42天時，每重復選取1只接近平均體重的肉雞稱重，頸靜脈放血處死，分離空腸，取腸段中部約1.5 cm固定于10%的福爾馬林溶液，將固定好的腸段用乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，用蘇木精-伊紅(HE)染色，光學顯微鏡下觀察。測量腸段絨毛高度、隱窩深度，計算絨毛高度/隱窩深度(VH/CD)。

　　1.5.3 腸道黏膜免疫球蛋白含量

　　取肉雞空腸中部靠前約5 cm長，刮取空腸黏膜，置液氮中保存，測定分泌型免疫球蛋白A(SlgA)和免疫球蛋白G(IgG)含量。采用南京建成生物工程研究所試劑盒測定。

　　1.5.4 腸道損傷計分

　　取肉雞空腸中部靠后約7 cm的腸段，將腸段剪開，用生理鹽水清洗干凈，用濾紙將水吸干，肉眼觀察腸道病變并計分。

　　計分標準：0=無肉眼可見的損傷；1=腸壁薄或易碎(充血)；2=小的局灶壞死或潰瘍(1~5灶)；3=局灶性壞死或潰瘍。

　　1.5.5 腸道微生物數量

　　分離盲腸，收集盲腸食糜，置液氮中保存，測定腸道微生物，包括總菌、乳酸桿菌、大腸桿菌和產氣莢膜梭菌數量。提取DNA試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司。使用RT-PCR Taqman探針法測定盲腸微生物數量。參照鐘麗梅等[6]方法測定，試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。結果用每克內容物中細菌數量的常用對數表示[lg(拷貝數/g)]。

　　1.6 數據統計

　　數據經Excel 2013整理，SPSS 19.0軟件分析，采用one-way ANOVA程序進行單因素方差分析，Duncan氏法進行多重比較。試驗結果以“平均值±標準差”表示，P < 0.05為顯著差異，P < 0.01為差異極顯著。

　　2 結果

　　2.1 枯草芽孢桿菌對產氣莢膜梭菌攻毒肉雞生長性能的影響

　　從表 2可以看出，第1~21天，各組間體重、體增重和采食量沒有顯著差異(P > 0.05)，產氣莢膜梭菌攻毒后，各組F/G有升高趨勢(P=0.051)，CP組F/G在數值上高于其他各組(P > 0.05)。第22~28天和第29~42天，各組間生長性能差異均不顯著(P > 0.05)，從數值上來看，ENRA組、BS組和ENRA+BS組的F/G較CP組有所降低，但差異不顯著(P > 0.05)。全期，各組間體增重和采食量均沒有顯著差異(P > 0.05)，ENRA組和ENRA+BS組的F/G顯著低于CP組(P < 0.05)。

　　2.2 枯草芽孢桿菌對產氣莢膜梭菌攻毒肉雞空腸病變計分的影響

　　從表 3可以看出，第21天，CP組計分最高，CON組最低，ENRA組、BS組和ENRA+BS組的計分低于CP組。第28天，CP組的計分最高，極顯著高于其余各組(P < 0.01)。第42天，各組計分沒有顯著差異(P > 0.05)。

　

　　2.3 枯草芽孢桿菌對產氣莢膜梭菌攻毒肉雞空腸形態的影響

　　從表 4可以看出，第21天和第42天時，ENRA組隱窩深度極顯著低于CP組、BS組和ENRA+BS組(P＜0.01)。第42天時，與CP組相比，ENRA組VH/CD顯著增加(P＜0.05)，BS組和ENRA+BS組VH/CD有提高趨勢(P > 0.05)。第28天時，組間各項指標沒有顯著差異(P＞0.05)。

　　2.4 枯草芽孢桿菌對產氣莢膜梭菌攻毒肉雞空腸黏膜IgG和SIgA含量的影響

　　從表 5可以看出，第21天時，與CP組相比，ENRA+BS組SIgA含量顯著增加(P < 0.05)；第28天時，與CP組相比，BS組和ENRA+BS組IgG含量顯著增加(P < 0.05)；第42天時，各組IgG和SIgA含量差異均不顯著(P > 0.05)。

　　2.5 枯草芽孢桿菌對產氣莢膜梭菌攻毒肉雞盲腸微生物數量的影響

　　從表 6可以看出，與CP組相比，ENRA組、BS組和ENRA+BS組第21天大腸桿菌數量極顯著降低(P < 0.01)，ENRA組乳酸桿菌數量顯著增加(P < 0.05)，BS組和ENRA+BS組乳酸桿菌數量有所增加(P > 0.05)，ENRA組、BS組和ENRA+BS組第28天產氣莢膜梭菌數量極顯著降低(P < 0.01)。各組間總菌數量差異不顯著(P > 0.05)。

　　3 討論
     3.1 枯草芽孢桿菌對產氣莢膜梭菌攻毒肉雞生長性能的影響

　　臨床上NE會引起肉雞嚴重的腸道損傷和死亡，而亞臨床癥狀會降低屠宰時肉雞的體重、采食量和飼料轉化效率[7]。本試驗表明，產氣莢膜梭菌攻毒后，肉雞第1~21天F/G有增加趨勢，與李慧賢等[8]的研究結果一致，該研究表明產氣莢膜梭菌感染肉雞會導致早期飼料轉化效率在數值上的下降。同時本試驗發現添加枯草芽孢桿菌后，各生長性能指標均有所提高。關于枯草芽孢桿菌對肉雞生長性能的影響研究大多在正常條件下進行，飼糧中添加枯草芽孢桿菌對肉雞前期的生長性能沒有顯著影響[9]；飼糧中添加枯草芽孢桿菌肉雞全期生長性能與攻毒組無顯著差異[10]；芽孢桿菌對雞平均日增重的影響存在時間上的積累性，而非速效性[11]。在產氣莢膜梭菌攻毒條件下的研究較少，宮秀燕等[12]研究表明，在產氣莢膜梭菌感染后，飼糧中添加凝結芽孢桿菌有增加肉雞體重的趨勢。本試驗結果表明，產氣莢膜梭菌攻毒后，恩拉霉素和枯草芽孢桿菌混合使用顯著降低肉雞第1~42天F/G，添加枯草芽孢桿菌對肉雞第1~42天F/G有一定的改善作用，而對肉雞前期生長性能沒有顯著影響。本試驗結果表明，枯草芽孢桿菌和恩拉霉素混合使用可改善產氣莢膜梭菌攻毒后肉雞的生長性能。

　　3.2 枯草芽孢桿菌對產氣莢膜梭菌攻毒肉雞空腸形態和病變的影響

　　腸道形態包括絨毛高度、隱窩深度和VH/CD。小腸絨毛是肉雞消化和吸收營養物質的特有結構，絨毛高度、隱窩深度直接影響小腸的吸收面積[13]，絨毛高度增高，吸收養分成熟細胞就會增多，吸收養分的能力就越強。隱窩深度反映了細胞生成率，隱窩變淺說明細胞成熟率上升，分泌功能增強[14-15]。VH/CD綜合反映小腸絨毛吸收功能，VH/CD增大，說明絨毛對營養物質的吸收能力增強，VH/CD減小時則減弱。產氣莢膜梭菌攻毒后，患有NE肉雞的空腸絨毛高度和VH/CD相比健康肉雞低[16]。本試驗發現，產氣莢膜梭菌攻毒后的肉雞空腸黏膜絨毛高度和VH/CD在數值上都有所下降，但差異不顯著。飼糧中添加枯草芽孢桿菌能顯著降低空腸隱窩深度, 提高VH/CD[17]。臨武鴨飼糧中添加5.0×1010 CFU/kg枯草芽孢桿菌，對空腸VH/CD有顯著影響[18]。枯草芽孢桿菌PB6可改善產氣莢膜梭菌攻毒后肉雞的腸道形態[19]。本試驗結果表明，產氣莢膜梭菌攻毒后，枯草芽孢桿菌對肉雞腸道形態沒有顯著影響, 在數值上略微提高了肉雞第21天和第42天空腸絨毛高度和VH/CD。這說明枯草芽孢桿菌在本試驗中對攻毒后的肉雞腸道形態上有一定的作用，但效果不明顯，與前人研究結果不完全一致。這可能與枯草芽孢桿菌的添加量、飼養環境、產氣莢膜梭菌攻毒效果等因素有關。

　　肉雞NE嚴重程度主要根據病變評分或死亡率量化[20-21]。本試驗表明，產氣莢膜梭菌攻毒顯著增加了第28天空腸病變計分，與Wu等[16]的報道一致。添加芽孢桿菌對腸道損傷有明顯的改善效果。Jayaraman等[19]研究表明，肉仔雞在產氣莢膜梭菌攻毒后添加枯草芽孢桿菌，第28天的腸道損傷計分顯著低于攻毒組。宮秀燕等[12]研究表明，凝結芽孢桿菌能降低腸道病變計分。本試驗結果顯示，第28天時，產氣莢膜梭菌攻毒后，添加枯草芽孢桿菌及恩拉霉素和枯草芽孢桿菌混合使用顯著降低了肉雞空腸損傷計分，與前人報道結果一致。這說明枯草芽孢桿菌可以降低腸道病變計分，防止肉雞患NE，提高腸道健康。

　　3.3 枯草芽孢桿菌對產氣莢膜梭菌攻毒肉雞空腸黏膜IgG和SIgA含量的影響

　　腸道黏膜中IgG和SIgA可加強腸道細胞吞噬作用，SIgA是胃腸道和黏膜表面主要免疫球蛋白，是防御病菌在腸道黏膜黏附和定植的第1道防線[22-23]。益生菌可在腸道黏附定植，發揮特異性免疫作用活化相關淋巴組織，使SIgA生物合成增加，提高黏膜免疫功能[24]。Vinderola等[25]用瑞士乳桿菌灌喂小白鼠，小腸中SIgA漿細胞數量有所增加，提示益生菌能增強黏膜免疫功能。王麗鳳[26]研究表明，飲水喂給益生菌植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum P-8)可顯著提高14及42日齡肉雞腸液中SIgA含量。唐志剛等[27]研究表明，在不同營養水平飼糧中添加益生菌，能提高21和42日齡肉雞腸道黏膜中IgG和42日齡黏膜中SIgA含量。本試驗結果表明，產莢膜梭菌攻毒后，ENRA+BS組顯著增加第21天空腸黏膜SIgA含量，BS組和ENRA+BS組顯著增加第28天IgG含量，說明枯草芽孢桿菌在產氣莢膜梭菌攻毒后能提高腸道免疫功能。

　　3.4 枯草芽孢桿菌對產氣莢膜梭菌攻毒肉雞盲腸微生物數量的影響

　　動物胃腸道內微生物區系的平衡主要由有益菌(乳酸桿菌、雙歧桿菌)維持，如果胃腸道有害菌(大腸桿菌、沙門氏菌)繁殖過度，造成微生物區系紊亂，可能造成動物腸道疾病。據報道，芽孢桿菌可以使胃腸道內有益菌的數量增加，這些細菌會產生大量乳酸降低腸道內pH，從而抑制有害菌的增殖。Jayaraman等[19]研究表明，產氣莢膜梭菌攻毒后，攻毒組顯著增加第28天產氣莢膜梭菌的數量。本試驗結果與前人研究一致。易中華等[28]研究表明，枯草芽孢桿菌能減少肉雞盲腸中的總需氧菌、大腸桿菌和沙門氏菌數量，增加乳酸桿菌數量。Li等[29]研究表明，枯草芽孢桿菌降低盲腸中產氣莢膜梭菌和大腸桿菌數量。La Ragione等[30]研究報道，枯草芽孢桿菌能減少肉雞經口服低劑量產氣莢膜梭菌后腸道產氣莢膜梭菌數量。本試驗結果表明，產氣莢膜梭菌攻毒后，枯草芽孢桿菌以及枯草芽孢桿菌和恩拉霉素混合使用均能降低第21天盲腸大腸桿菌數量和第28天產氣莢膜梭菌數量，與前人研究結果一致。這說明枯草芽孢桿菌可以抑制腸道有害菌的增殖，保護腸道健康。

　　4 結論

　　枯草芽孢桿菌及恩拉霉素和枯草芽孢桿菌混合使用可降低產氣莢膜梭菌感染肉雞的腸道病變計分，促進小腸絨毛的生長發育，提高腸道免疫功能，促進有益菌的增殖，抑制有害菌的增殖，從而改善肉雞的生長性能。

　　作者：胡均 , 張克英 , 白世平 , 王建萍, 曾秋鳳 , 彭煥偉 , 欒超 , 丁雪梅
　　參考文獻：略
　　來源：動物營養學報