酸溶蛋白能否用來判定發酵豆粕中的小肽含量？【三】

畜牧人小李

發酵豆粕含有豐富的益生菌及其代謝產物，這些物質可改善動物腸道微生態環境，有利于營養物質吸收。與豆粕相比，發酵豆粕含有豐富的小肽、氨基酸，有利于合成動物體內自身氨基酸和組織，提高機體免疫能力，抵御外來病原體入侵，目前行業普遍用酸溶蛋白指標評估發酵豆粕中小肽含量，該指標是否能對發酵豆粕品質進行“代言”呢。

一、肽的概念

定義：食品國家標準《大豆肽粉GBT 22492》2008 版將小肽的定義由<10 KDa 降低到<5 KDa。營養學上關于小肽的定義稍有差別，但是以分子量范圍來定義是共識。

檢測原理：高分子蛋白質在酸性條件下易被沉淀，相對分子質量較小的蛋白質水解物(酸溶蛋白質)可溶于酸性溶解液(其中包含肽及游離氨基酸)。樣品經酸化后，濾液中的酸溶蛋白質含量減去游離氨基酸含量即為肽含量。(GB/T22492-2008大豆肽粉)

二、酸溶蛋白

酸溶蛋白是目前飼料行業用于檢測發酵豆粕中小肽含量的一個指標，具有成本低，易于操作的優點。

通常情況下，多肽鏈的水溶性取決于形成多肽的氨基酸之間的肽鍵和氨基酸側鏈和水分子之間的相互作用力。多肽和蛋白質的離子特性和溶解性都取決于組成它的氨基酸的特性。

在受到外界不平衡條件的情況下，如物理條件(高溫，紫外線，劇烈振蕩等)和一些外部環境化學成分的變化(強酸，強堿，重金屬鹽等)，會使得蛋白質的側鏈帶電情況發生變化，從而導致進一步的分子結構發生變化。(如圖二)。在高濃度的三氯乙酸溶液里，蛋白分子會與之相互作用，形成不溶性鹽;同時強酸作為變性劑，會使得蛋白質的構象發生改變，暴露出較多的疏水基團，使之聚沉。

影響酸溶蛋白數值的三個因素：肽鏈的長度、疏水性以及低pH下蛋白片段的帶電情況。這三個因素共同決定溶解在三氯乙酸溶液中的蛋白含量，肽鏈長度越長，疏水性越強，溶解度越小。

因此，發酵豆粕的酸溶蛋白含量，很大程度上的取決于發酵使用的菌株特性，芽孢桿菌，乳酸菌，酵母菌，霉菌等，由于不同的菌株代謝產生的酶的種類不同，通過發酵產生出來的大豆蛋白片段長短，末端氨基酸，蛋白片段的氨基酸種類和帶電性不同，使得在高濃度的三氯乙酸中溶解程度是不一樣的。

實驗證明，15%TCA溶液能溶解的蛋白質分子量范圍是在5kDa以下(見下圖三)，最大部分溶解的是2kDa(由約18個氨基酸組成)左右大小的蛋白質分子。

圖三是利用凝膠滲透色譜法(GPC, HPLC的一種)測定的蛋白質分布情況。在凝膠柱中，蛋白質大分子通過由于無法進入凝膠中的孔徑，因此從凝膠間孔徑快速通過，在色譜圖的前端出現;蛋白質小分子可通過凝膠中的孔徑，因此洗脫緩慢，在峰值的后端出現。

我們可以看到圖三中，圖譜的結果是不同種類的發酵豆粕產品在三氯乙酸中溶解出來的上清液中的蛋白質分布情況，可以看到蛋白的峰值是從5kDa開始出現的，最高的峰值出現在2-3kDa之間，說明了TCA溶解出來的小肽的分子量都在5kDa以下的。

然而，并不是所有小于5kDa的多肽分子都能被溶解。(見下圖四)

圖四中實驗結果，同時測定的發酵豆粕樣品整體蛋白分布(紅色峰)和三氯乙酸溶解后上清液的蛋白分布結果(藍色峰)。可以看到，三氯乙酸提取的分子量5kDa以下蛋白質部分，而紅色圖譜和藍色圖譜之間存在一個灰色的面積區域是TCA沒有辦法提取出來的樣品中的肽含量的部分，即TCA并不能完全溶解出樣品中的所有的肽，只能溶解出其中的一小部分。因此，利用酸溶蛋白溶解出來的蛋白含量來判定樣品的小肽含量，結果是片面的，不準確的。

這是因為酸溶蛋白的值大小取決與多肽片段的大小，以及構成蛋白質的氨基酸和多肽的疏水性，因此，三氯乙酸沉淀的并不都是大分子蛋白質;同時一些非蛋白氮和游離氨基酸也會被溶解在上清液中一起被檢測出來。另外，由于三氯乙酸本身的刺激性氣味，強酸，強腐蝕性，我們都不建議使用三氯乙酸沉淀法去判斷小肽含量。

目前，現有的小肽檢測方法——酸溶蛋白顯然并不能準確的反應發酵豆粕中肽的含量;最準確的可以測定出小肽含量和小肽分布情況的方法是利用高效液相色譜去測定，但由于需要專業的技術人員和設備，檢測成本相對較高，一般不作為出廠檢測的推薦方法。韓國希杰集團研究所在發酵豆粕-速益肽產品的長期研究過程中，韓國希杰集團研究所在發酵豆粕-速益肽產品的長期研究過程中發現發酵豆粕的水溶性蛋白(NSI值)含量和高效液相法(GPC<30 kDa的肽含量)測定肽含量值存在高度正相關關系。在后續推文中會詳細闡述，敬請關注!

（文章來源：CJ希杰BestProtein）