探討《芽孢桿菌活菌檢測方法》

孟俊英

一培養基

營養瓊脂培養法

二用具及試劑

超凈工作臺、滅菌平皿、酒精燈、滅菌試管15×150型及18×180型（放入幾粒玻璃珠并加棉塞）、5000/2000/200μL滅菌槍頭、無菌水、玻璃涂棒、培養箱。

三步驟

1 制備平板

將營養瓊脂滅菌后待冷至55~60℃時倒平板，右手持盛培養基的三角瓶置火焰旁邊，用左手將瓶塞輕輕拔出，瓶口保持對著火焰；然后左手拿培養皿并將皿蓋在火焰附近打開一縫，迅速倒入培養基約15亳升，加蓋后輕輕搖動培養皿，使培養基均勻分布在培養皿底部，然后平置在桌面上待凝，培養基凝固后將平板倒置于37℃培養箱中24h進行無菌檢測，無雜菌污染者備用。

2 有效菌數及雜菌率的測定

以無菌操作將經過充分混勻的試樣5g，80℃滅菌10min，放入含有495mL無菌水帶玻璃珠的滅菌三角瓶內，靜置20min后置于旋轉式搖床上，以200rpm的轉速搖min，即成1%的稀釋液。

用經過滅菌的1000μL移液器（槍頭滅菌）吸取1%的稀釋液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL無菌水的試管內（注意槍頭尖端不要觸及管內稀釋液），混勻成1：1000稀釋的菌懸液，這樣依次稀釋，分別得到1：1×104、1：1×105、1：1×106、1：1×107、1：1×108等濃度（每個稀釋度必須更換無菌槍頭）。

用200μL移液器分別吸取稀釋度為1：1×106、1：1×107、1：1×108的稀釋液100μL，加至平皿內的無菌培養基表面，用無菌涂布器將菌懸液均勻地涂布于培養基表面。每一稀釋度重復3次，同時加無菌水的空白對照，37℃培養20~40h，每個稀釋度取5~10個菌落的菌體，涂片染色，顯微鏡觀察識別后計數菌落。

3 菌落計數

以平板上出現30-300個菌落數的稀釋度為計數標準。

當只有一個稀釋度，其平均菌落數在30~300之間，則以該平均菌落數乘以其稀釋倍數；

若有兩個稀釋度，其平均菌落數均在30~300之間，應按兩面三刀者菌落總數之比值來確定；若其比值小于等于2應計數兩者的平均數，若大于是則計數其中稀釋度較小的菌落總數；

若三個稀釋度的平均菌落數均大于300，則應按稀釋度最高的平均菌落數乘以稀釋倍數；

若三個稀釋度的平均菌落數均小于30，則應按稀釋度最低的平均菌落數乘以稀釋倍數；

若三個稀釋度的平均菌落數確均不在30~300之間，則以最近300或30的平均菌落數乘以稀釋倍數。

4 計算

每克樣品的菌數同一稀釋度幾次重復的平均菌落數×10×稀釋倍數

雜菌率=雜菌數/總菌數×100%

首先聲明這個方法除斜體字部分外均是引用某公司推薦檢驗方法。因為存疑所以發貼在此探討：

（1）斜體字部分是滅菌方法，應對芽孢桿菌的休眠體無損。如果模擬飼料加工條件則干熱滅菌與濕熱滅菌那個更適合？（注：畜禽飼料制粒時通入的是干飽和蒸汽；水產料則不盡然）

（2）這個培養方法對不同品種的芽孢桿菌的檢測結果是否有可比性？

孟俊英

回復 2# 登高遠眺

請談一談這種方法的有效性。是否仍有改進之處

lswst

菌落計數部分好像有些自相矛盾