喹乙醇--------想說愛你不容易

言西早 · 發(fā)表于 2010-4-17 10:11:39

[p=30, 2, left][b][font=SimHei][size=15pt]穿梭質(zhì)粒pSP189/哺乳動物Vero細胞檢測系統(tǒng)在[b]喹[/b][b]乙醇[/b]誘變分子機制研究中的應用[/size][/font][/b][/p][p=30, 2, left]郝利華，肖希龍，周宗燦[/p][p=30, 2, left](1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081；2.中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京　100094；3.北京大學醫(yī)學部，北京　100083)[/p][p=30, 2, left][b][size=12pt]Molecular Mechanism of Mutag-enesis Induced by OlaquindoxUsing a Shuttle Vector pSP189/Mammalian Cell System[/size][/b][/p][p=30, 2, left]HAO Li-hua, XIAO Xi-long,?,ZHOU Zong-can[/p][p=30, 2, left](1.China Institute of Veterinary Drug Control, Beijing 100081,China;2.Department of Pharmacology and Toxicology, College of Veterinary Medicine,China University of Agricnltwre,Beijing 100094,China; 3.Department of Health Toxicology, College of Medicine, Beijing University, Beijing 100083,China)[/p][p=30, 2, left]　　【摘要】背景與目的：將短暫復制型穿梭質(zhì)粒pSP189與非洲綠猴腎細胞(Vero細胞系)組成穿梭質(zhì)粒/哺乳動物細胞誘變檢測系統(tǒng)，并將該系統(tǒng)應用于[b]喹[/b][b]乙醇[/b]的誘變性檢測。材料與方法：質(zhì)粒經(jīng)6.6μg·ml－1[b]喹[/b][b]乙醇[/b]處理后，轉(zhuǎn)染Vero細胞，從細胞中回收質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli MBM7070指示菌篩選突變體。結(jié)果： [b]喹[/b][b]乙醇[/b]處理組的誘變頻率(24×10－4)明顯高于溶劑對照組(1.2×10－4)；試驗進一步對61個突變子中的24個突變子質(zhì)粒靶基因進行序列分析，發(fā)現(xiàn)[b]喹[/b][b]乙醇[/b]引起質(zhì)粒靶基因核苷酸序列改變主要表現(xiàn)為點突變和連續(xù)缺失，且以引發(fā)點突變?yōu)橹鳎伎倲?shù)的70％。點突變主要集中在G:C堿基對，且包含在5'-NNTTNN-3'的序列中，其中的N位易發(fā)生突變，主要表現(xiàn)為G:C-T:A或G:C-A:T置換；而缺失以連續(xù)缺失為主，包含在含ANGGCCNAAA的序列中。結(jié)論： [b]喹[/b][b]乙醇[/b]能誘發(fā)質(zhì)粒pSP189靶基因突變。[/p][p=30, 2, left]　　【關(guān)鍵詞】穿梭質(zhì)粒； Vero細胞；突變； [b]喹[/b][b]乙醇[/b][/p][p=30, 2, left]　　中文分類號： S816.2;R394.6　　　　文獻標識碼： A　　　　文章編號： 1004－616X(2006)01－0023－03[/p][p=30, 2, left]
[/p][p=30, 2, left]　　【ABSTRACT】 BACKGROUND ＆ AIM: Using a new SV40-based shuttle vector pSP189 and African green monkey kidney cells(Vero E6 cell line)，we constituted a shuttle vector /mammalian cell system to detect mutagenesis in vitro induced by olaquindox. MATERIAL AND METHODS: The vector plasmids were trealed by olaquindox , then transfected into Vero cells. After recovery from cells, the plasmids were transformed into MBM7070 and mutant colonies were selected. The mutation in 24 mutants was determined by dideoxy sequence analysis. RESULTS: The lesion induced by 6.6μg·ml－1 olaqiunxox included a large number of base substitutions, in addition to tandem base deletion. Point mutation frequencies of modified plasmids in vitro were dramatically increased to 70％ the spontaneous background level,and base substitutions concentrated on the G:C base pair, the predominant mutation was G:C-T:A or G:C-A:T. Olaqiundox-induced mutations on the SupF shuttle vector was not distributed randomly, they had mutation hot spots (155bp) and sequence specificity, which were contained in the sequence 5＇-NNTTNN-3＇. Mutation was common in N site,tandem base deletion or rearrangement focused on ANGGCCNAAA sequence. CONCLUSION: Olaquindox could induce plasmid shuttle vector mutagenesis.[/p][p=30, 2, left]　　【KEY WORDS】 shuttle vector; olaquindox; mutagenesis; Vero cells[/p][p=30, 2, left]　　穿梭質(zhì)粒帶有對突變敏感的靶基因，將誘變劑處理的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞或先轉(zhuǎn)染細胞后經(jīng)誘變劑處理，在細胞內(nèi)修復和復制后，回收質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌，在一定條件下篩選突變子，并進一步對突變子靶基因測序以分析突變的位點、類型、序列特異性等信息，從而研究誘變劑的誘變機制。由于誘變是在哺乳動物細胞內(nèi)發(fā)生的，因而能夠較真實的反映高等動物的誘變機制；且誘變的發(fā)生通過宿主菌顯色反應來顯示，其任一位置發(fā)生的單堿基置換都能從表型改變表現(xiàn)出來；進一步對突變子靶基因進行序列分析，使表型的改變在DNA分子水平上得到證明，敏感性極高[1]。因此穿梭質(zhì)粒被廣泛應用于各種誘變劑的誘變性研究[2～4]。[/p][p=30, 2, left]　　[b]喹[/b][b]乙醇[/b]由于其優(yōu)良的[b]抗菌[/b][b]促[/b][b]生長[/b][b]作用[/b]，在我國被廣泛應用于豬和魚類的飼料添加劑中。[b]喹[/b]　啉類藥物分子結(jié)構(gòu)有很大的相似性，均為[b]喹[/b]叨嗪的衍生物，[b]喹[/b]叨嗪由于其遺傳毒性被禁用 [5]，由此引發(fā)人們對這類藥物遺傳毒性的研究[6，7]。試驗證明卡巴氧和[b]喹[/b][b]乙醇[/b]在嚙齒類動物表現(xiàn)出基因毒性和致癌性[8，9]；研究還發(fā)現(xiàn)[b]喹[/b][b]乙醇[/b]引發(fā)飼養(yǎng)場工人發(fā)生過敏和光敏感性皮炎[10]。鑒于上述原因，歐盟委員會認為[b]喹[/b][b]乙醇[/b]和卡巴氧的休藥期不能確定，其對人體健康存在可能的不良[b]作用[/b]，于1999年1月1日正式撤消[b]喹[/b][b]乙醇[/b]和卡巴氧用作[b]促[/b][b]生長[/b]添加劑[11]。而[b]喹[/b][b]乙醇[/b]在我國仍然作為[b]抗菌[/b][b]促[/b][b]生長[/b]添加劑被廣泛使用，我們用穿梭質(zhì)粒pSP189/哺乳動物Vero細胞系統(tǒng)研究[b]喹[/b][b]乙醇[/b]的誘變性，探討[b]喹[/b][b]乙醇[/b]對質(zhì)粒靶基因SupF上[b]作用[/b]的位點、誘變類型及序列特性。[/p][p=30, 2, left]
[/p][p=30, 2, left]　　1　材料與方法[/p][p=30, 2, left]　　1.1　細胞、質(zhì)粒及其宿主菌　穿梭質(zhì)粒pSP189及其宿主菌E.Coli MBM7070由美國NIH9900醫(yī)學中心Seidman教授贈送。Vero細胞由浙江省醫(yī)學科學院病毒病研究所柴少愛副所長惠贈，在含1×105 U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素、10 ％小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)。[/p][p=30, 2, left]　　1.2　試劑[b]　[/b][b]喹乙[/b]醇(含量：99 ％)：中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；轉(zhuǎn)染試劑盒Lipofectamine2000、DpnⅠ內(nèi)切酶promega公司產(chǎn)品；X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)、IPTG(異丙基-β-D-半乳糖苷)，Gibco公司產(chǎn)品；其它試劑均為國產(chǎn)和進口分析純。[/p][p=30, 2, left]　　1.3　質(zhì)粒染毒及轉(zhuǎn)染　轉(zhuǎn)染前一天接種5×105個細胞于25 cm2培養(yǎng)瓶中，用不含雙抗的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)使細胞密度達70 ％～90 ％；于細胞體外直接將[b]喹[/b][b]乙醇[/b]以6.6 μg/ml[12]的劑量在37 ℃[b]作用[/b]質(zhì)粒60 min，形成質(zhì)粒DNA-[b]喹[/b][b]乙醇[/b]加合物[13]，用高效轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000進行轉(zhuǎn)染，按說明書操作。轉(zhuǎn)染細胞在含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng) 48～72 h后收獲質(zhì)粒。[/p][p=30, 2, left]　　1.4　質(zhì)粒回收　從Vero細胞中回收質(zhì)粒按Seidman提供的材料操作。[/p][p=30, 2, left]　　1.5　質(zhì)粒轉(zhuǎn)化篩選突變體　取2 μl回收的質(zhì)粒用CaCl2法轉(zhuǎn)化MBM7070指示菌，在含氨芐西林(100 mg/L)、X-gal(2 ％)和IPTG(20 ％)的LB固體培養(yǎng)基上篩選突變體。藍色菌落為野生型，白色菌落為突變型，用雙脫氧鏈法對突變子質(zhì)粒靶基因進行序列分析。[/p][p=30, 2, left]
[/p][p=30, 2, left]　　2　結(jié)　果[/p][p=30, 2, left]　　2.1　[b]喹[/b][b]乙醇[/b]誘發(fā)質(zhì)粒靶基因突變頻率分析　質(zhì)粒從Vero細胞中回收后，轉(zhuǎn)化指示菌在含Amp、X-gal、IPTG的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)所得轉(zhuǎn)化子、突變子數(shù)以及突變頻率結(jié)果見表1。結(jié)果表明溶劑對照組獲得的約8496個轉(zhuǎn)化子中有1個白色的突變子，自發(fā)突變頻率為1.2×10－4，而[b]喹[/b][b]乙醇[/b]誘發(fā)突變頻率為24×10－4，高出溶劑對照近22倍，突變檢出明顯。[/p][p=30, 2, left]
[/p][p=30, 2, left]　　2.2　[b]喹[/b][b]乙醇[/b]誘發(fā)質(zhì)粒靶基因突變序列測定結(jié)果[/p][p=30, 2, left]　　2.2.1　突變譜[b]　[/b][b]喹乙[/b]醇誘發(fā)的61個突變子中所測24個突變子質(zhì)粒靶基因SupF tRNA核苷酸序列測定結(jié)果見圖1，圖中結(jié)果顯示[b]喹[/b][b]乙醇[/b]誘發(fā)質(zhì)粒靶基因發(fā)生點突變、缺失和重組。[/p][p=30, 2, left]　　2.2.2　突變類型、突變位點及突變次數(shù)[b]　[/b][b]喹乙[/b]醇誘發(fā)的質(zhì)粒靶基因突變類型、突變位點、突變次數(shù)結(jié)果見表2。表中結(jié)果顯示[b]喹[/b][b]乙醇[/b]引起質(zhì)粒靶基因發(fā)生點突變、堿基插入、堿基缺失和重組；以誘發(fā)點突變?yōu)橹鳎c突變集中于155、111和128位點；而缺失發(fā)生于108～145 bp，這段序列也可發(fā)生堿基重組；172位點發(fā)生兩次單堿基插入。[/p][p=30, 2, left]2.2.3　突變的序列特異性　對點突變和缺失及重組的位點進行序列分析，見表3，發(fā)現(xiàn)其中3個點突變位點(105、155、164)均包含在 5'-NNTTNN-3'(N為G或C)序列中，而突變發(fā)生在N位，由此可見-NNTTNN-序列的N位易發(fā)生點突變；而缺失和重組主要發(fā)生在含有ANGGCCNAAA的序列中，因此ANGGCCNAAA序列易引起缺失和重組。由此可見[b]喹[/b][b]乙醇[/b]誘發(fā)質(zhì)粒靶基因核苷酸序列改變并非隨機而是存在一定的序列特異性。[/p][p=30, 2, left]
[/p][p=30, 2, left]　　3　討　論[/p][p=30, 2, left]　　我們的試驗結(jié)果表明[b]喹[/b][b]乙醇[/b]主要引起質(zhì)粒DNA序列發(fā)生缺失和點突變，且突變在靶基因SupF tRNA上的分布是存在著一定的序列特異性。[/p][p=30, 2, left]　　我們試驗結(jié)果表明[b]喹[/b][b]乙醇[/b]誘發(fā)質(zhì)粒靶基因突變，即[b]喹[/b][b]乙醇[/b]有致基因突變的[b]作用[/b]，與Ames實驗[8]、體外誘變哺乳動物細胞實驗[14]、哺乳動物體內(nèi)誘變實驗[6，7]等結(jié)果一致；而本試驗首次在質(zhì)粒DNA一級結(jié)構(gòu)上具體論證了[b]喹[/b][b]乙醇[/b]誘發(fā)突變發(fā)生的位點、類型、熱點以及序列特異性信息，從分子水平上闡明了[b]喹[/b][b]乙醇[/b]誘發(fā)突變的特征，為[b]喹[/b][b]乙醇[/b]的致突變性提供新的理論依據(jù)。[/p][p=30, 2, left]　　質(zhì)粒和細胞可以用誘變劑分別處理，既可以分析誘變劑引起質(zhì)粒DNA的直接損傷，即定標性突變(Targeted-Mutation)；也可分析誘變劑引起宿主細胞內(nèi)環(huán)境改變從而造成質(zhì)粒DNA分子的間接損傷，即非定標性突變(Non-targeted-Mutation)。本試驗只對[b]喹[/b][b]乙醇[/b]引發(fā)質(zhì)粒DNA的定標性突變進行了研究，如果結(jié)合其引發(fā)的非定標性突變，并比較兩者引起質(zhì)粒DNA一級結(jié)構(gòu)改變的差異，同時測定[b]喹[/b][b]乙醇[/b]引起質(zhì)粒靶基因核苷酸序列改變是否有劑量-反應關(guān)系，則對[b]喹[/b][b]乙醇[/b]在哺乳動物細胞突變機制的研究就更為全面，這有待進一步研究。[/p][p=30, 2, left]　　總之，目前所用的穿梭質(zhì)粒系統(tǒng)都是檢測質(zhì)粒靶基因DNA的突變結(jié)果。而化學致突物干擾細胞DNA復制和修復或直接結(jié)合在DNA上造成的損傷還不能被檢測，如果能從這一層面研究誘變物的突變[b]機理[/b]，則研究結(jié)果將更具體和深入。[/p]