甘露寡糖和螯合鋅對斷奶仔豬生產性能、腸道微生物

apple12151007 · 發表于 2010-10-12 14:57:07

　　甘露寡糖和螯合鋅對斷奶仔豬生產性能、腸道微生物

　　和腸道組織形態的影響

　　M.Castillo(著);付建福1(譯)

　　摘要：在日糧中添加甘露寡糖、有機鋅及其它們的混合物可以提高斷奶仔豬的生產性能、胃腸道的健康和免疫力。選擇128頭20±2d日齡的斷奶仔豬，隨機分為4個處理，每個處理8個重復，每個重復4頭。日糧分別為基礎日糧+0(CT組),0.2%的甘露寡糖(BM組)，80mg/Kg的鋅(鋅來源于有機鋅)(BP組)和兩者的混合物(BMP組)。試驗期為5周，分為前期(0-2周)和后期(3-5周)。兩周過后，32頭仔豬屠宰，收集胃、回腸和盲腸的內容物，用這些樣品測定其PH和短鏈脂肪酸，用定量PCR來測量細菌總數、乳酸菌菌落數，并測量空腸的組織形態、血清中免疫球蛋白的濃度和回腸的內容物的IgA水平。結果表明：試驗組與對照組相比，提高了前期斷奶仔豬的G：F(CT組，BM組，BP組，BMP組分別為0.63，0.69，0.67和0.68， P<0.04)。BM組和BP組與對照組相比，減少了斷奶仔豬第21d腹瀉指數(CT組，BM組，BP組和BMP組，分別為1.22，0.89，0.87和1.06， P=0.002). BM組中斷奶仔豬減少了空腸的細菌總數(CT組，BM組，BP組，BMP組分別為9.13，8.05，8.87和7.89， P=0.05)。試驗組中回腸重量與對照組相比，呈增加趨勢，特別是BP組(CT組，BM組，BP組，BMP組分別為8.9，9.6，11.9和10.3g/Kg)。BPM組與對照組相比，顯著的降低了隱窩深度(281：235;P<0.03)。內容物的PH、短鏈脂肪酸濃度和血清中的免疫球蛋白濃度，試驗組與對照組無顯著性差異。結論：甘露寡糖和有機鋅可以提高斷奶仔豬的生產效率。
　　關鍵詞：BioMos，甘露寡糖，螯合鋅，生產性能，有機鋅，腹瀉
　　1.前言
　　減輕早期斷奶仔豬腹瀉是當今養豬業的主要挑戰之一。在生產實踐中，添加一些物質可以減輕仔豬斷奶產生的應急。其中具有代表性的就是甘露寡糖(MOS)和Zn，大量試驗表明，它們對斷奶仔豬的健康具有積極作用。Bio-Mos(葡萄糖甘露寡糖)是甘露寡糖一種，主要來源于酵母細胞壁提取物(Miguel等，2004)。研究表明，BioMos主要通過上皮細胞阻止細菌的生長(Spring，2000)和提高動物的免疫力(Newman等，2001;Quinn等，2001)。ZnO到達藥理學濃度(2000-3000mg/Kg)可以減少斷奶仔豬的腹瀉(Poulsen，1995)和提高斷奶仔豬的生產性能，但是作用機理尚未清楚。Zn對機體有作用(Case和Carlson，2002)。Davis等(2002)報道，高劑量的ZnO和BioMos可能具有正協同作用。然而，使用高劑量的無機鋅飼喂超過10d，才對動物有作用。有機鋅的生物學效價更高，仔豬得到同樣的生產性能，可以減少日糧中Zn的添加量和減少Zn的排放。
　　本試驗主要研究BioMos、有機鋅(螯合鋅)或兩者的混合物對斷奶仔豬生產性能、胃腸道健康和免疫力的影響。
　　2.材料與方法
　　2.1試驗動物和日糧
　　選擇128頭18-22日齡，平均體重為6.7±1.17Kg的斷奶仔豬(皮特蘭×長×大，66公豬和62豬。試驗分為4個處理，每個處理8個重復，每個重復4頭仔豬。它們分別飼喂在32個欄中，記錄仔豬初始重?；A日糧根據NRC(1998)的要求，適當的調整。個處理組的日糧分別為基礎日糧(見表1)+0(CT組),0.2%的甘露寡糖(BM組)，80mg/Kg的鋅(鋅來源于有機鋅)(BP組)和兩者的混合物(BMP組)。日糧中沒有其他的藥物添加劑。試驗期為5周，分為前期(0-2周)和后期(3-5周)。斷奶仔豬可以自由采食和飲水。
　　表1：前后期基礎日糧的組成及其營養水平

項目	試驗期
項目	前期	正式期
成分，g/Kg
膨化玉米	360.6	180.0
大麥	-	215.7
小麥	-	100.0
膨化小麥	240.2	120.0
豆粕，44%CP		93.0
豆油	40.0	93.0
大豆濃縮蛋白	60.0	60.0
麥麩	60.0
馬鈴薯蛋白	30.0
含脂乳清粉	30.0	30.0
乳清粉	150.0	80.0
碳酸鈣		7.0
磷酸鈣	16.0	9.0
食鹽		2.0
L-Lys-HCl,99%	5.0	3.0
DL-Met,99%	0.3	0.9
L-Thr,98%	0.7	0.7
L-Trp,98%	0.2
VB混合物	2.0	0.7
維生素和礦物質預混料添加劑	5.0	5.0
化學組成
CP，%	21.6	18.9
粗纖維，%	4.97	3.99
粗脂肪，%	3.58	4.14
灰分，%	4.9	4.9

　　2.2取樣
　　每周記錄仔豬的體重和飼料消耗和計算ADFI，ADG和G：F。前3周記錄糞便的評分。糞便的評分分為0-3，0分表示正常條形或粒狀，1分表示軟糞，能成形，2分表示稠狀，不成形，糞水無分離現象，3分表示液狀，不成形，糞水無分離現象。在14d，每個重復中的1頭仔豬，選擇體重接近的仔豬屠宰。屠宰前前腔靜脈采血用來測量血液中免疫球蛋白的濃度。記錄小腸的重量和回腸的重量。收集胃腸道的食糜用來測量它們的PH。樣品收集5g左右，迅速放在-20℃冰凍起來，用來分析短鏈脂肪酸的濃度?；啬c、盲腸、直腸的食糜也在-20℃冰凍和凍干，用來分析嘌呤。取接近1g的空腸食糜并放在酒精中，為了DNA提取和以后的微生物的研究(Castillo等，2006)。
　　2.3方法
　　2.3.1短鏈脂肪酸測定方法
　　分析短鏈脂肪酸用的是GLC方法，此方法用在Jensen等(1995)改進Richardson等(1989)試驗的方法。
　　2.3.2嘌呤測定方法
　　嘌呤濃度(腺嘌呤和鳥嘌呤)在凍干的食糜(40mg)用HPLC(Makkar和Becker，1999)測量。食糜加入2ml的2M HClO4后在100℃孵化1h，再加入0.5μl的1mM別嘌呤醇，核酸分子經過一系列的水解得到嘌呤。
　　2.3.3免疫球蛋白的測定方法
　　用ELISA間接法測量血清中的IgG、IgA、IgM的濃度。每個血樣在2000轉離心15min，上清液就是血清。測定IgA是用Swanson等(2002)測定的方法，用2g的樣品去干和用研缽磨碎，然后倒入Erlenmeyer瓶中，加入20ml的PBS溶液，調整PH到7.2.樣品在30min的室溫混合，在2000轉離心30min.，上清液收集?；啬c中的食糜的CP用Kjeldahl方法測定(AOAC，1990)，作為總的N含量，計算出回腸食糜的IgA濃度
　　2.3.4 DNA的提取
　　取400mg的食糜保存在3ml，96%的酒精中，用13000轉離心5min。DNA來自于沉淀物提取，凈化劑用商業的QIAamp DNAStool MiniKit(Qiagen，UK)，推薦的變性溫度增加到90℃，和延伸時加入溶解酵素增加細菌細胞的復制。在200μL的Qiagen Buffer AEDNA的洗提DNA和保存在-80℃.
　　2.3.5定量PCR
　　空腸總細菌和乳酸菌的測定。空腸中的食糜用SyBR綠色化學試劑，即時用PCR。過程和Castillo等(2006)測定的過程一樣。
　　2.3.6組織形態的測定方法
　　用福爾馬林浸泡的樣品，石蠟包埋和切片并染色。用顯微鏡觀察測量每個樣品的絨毛長度和隱窩深度。絨毛長度和隱窩深度都用平均值表示。絨毛高度是隱窩的開口到絨毛頂部。隱窩深度是從隱窩基地部到隱窩開口的水平距離。計算絨毛長度：隱窩深度。
　　表2：斷奶仔豬初始末體重，ADG，ADFI，G：F

項目	日糧				SEM	P值
項目	CT	BM	BP	BMP	SEM	P值
體重，Kg
開始	6.65	6.64	6.63	6.68	0.434	0.99
結束	17.71	17.80	18.00	18.56	1.025	0.94
ADFI，Kg
前期	0.24	0.22	0.24	0.24	0.011	0.58
后期	0.68	0.64	0.66	0.69	0.042	0.82
全期	0.50	0.47	0.49	0.51	0.023	0.54
ADG,Kg
前期	0.15	0.14	0.15	0.16	0.032	0.77
后期	0.43	0.44	0.44	0.47	0.039	0.72
全期	0.32	0.32	0.32	0.34	0.016	0.71
G：F，Kg/Kg
前期	0.62	0.63	0.61	0.66	0.052	0.88
后期	0.63b	0.69a	0.67a	0.68a	0.014	0.04
全期	0.63b	0.68a	0.65ab	0.67a	0.009	0.03

　　注：列行上標字母相同者表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母者表示差異顯著(P<0.05)
　　日糧CT為對照組，日糧BM為添加0.2%BioMos的日糧，BP為80mg/Kg的Zn的日糧，BMP為BioMos和Zn的混合添加的日糧。
　　前期：斷奶后0-2周;后期：斷奶后2-5周;前期：斷奶后0-5周
　　2.4數據分析
　　所有的數據使用分析軟件SAS的普通線性模型(GLM)進行差異性分析。
　　3.結果
　　3.1生產性能
　　BW、ADG、ADFI和G：F的結果見表2. 在各處理組的平均日增重和ADFI無顯著性差異(P>0.71)。在試驗后期，斷奶仔豬日糧中添加了BioMos和螯合鋅顯著的提高仔豬的G：F(P=0.04)。在整個試驗中仔豬飼喂BM和BMP顯著的提高了仔豬的G：F(P<0.05).
　　3.2腹瀉指數
　　在頭3周的斷奶仔豬的糞便評分。各處理組的糞便在0-4d都不成形(P=0.001)。在7d期間，BM組和BP組與對照組相比，降低了糞便的評分。但是，BMP組對糞便評分無影響(對照組，BM，BP和BMP組分別為1.43，0.38，0.71和1.63; P=0.02)。在整個試驗期，BM和BP組與對照組相比，糞便的評分有所增加(對照組，BM，BP和BMP組分別為1.22，0.89，0.87和1.06;P=0.002).
　　3.3腸的重量和長度
　　試驗日糧對所有的腸道重量和長度無影響。然而，回腸的重量呈增加的趨勢(P=0.08)(對照組，BM，BP和BMP組分別為8.91，9.56，11.92和10.34g).
　　3.4短鏈脂肪酸
　　日糧對斷奶仔豬的腸道中的內容物PH無影響(胃、回腸、盲腸的PH分別為3.2±0.29，6.7±和5.7±0.14)短鏈脂肪酸包括乙酸、丙酸、丁酸、戊酸，不同的日糧對短鏈脂肪酸無影響(胃、回腸、盲腸的短鏈脂肪酸的總量分別為7.9±1.05，12.5±2.01和134.4±7.49μmol/g)。短鏈脂肪酸的總量在各處理組中的含量都一樣(胃、回腸、盲腸的短鏈脂肪酸的總量分別為4.1±0.59，13.6±3.85和3.7±1.65μmol/g).
　　3.5細菌數量
　　回腸、盲腸和直腸中的內容物的嘌呤濃度，作為細菌數量和活性的估算。結果見表3. 從回腸到盲腸，增加嘌呤的濃度，但是各處理組無顯著性差異(P≥0.19)(回腸、盲腸、直腸分別為6.46，47.65和35.04μmol/g).
　　表3：斷奶后14d，回腸、盲腸和直腸中的食糜中含嘌呤濃度(μmol/g)和乳酸菌、
　　細菌總數數量及其它們的比值

項目	日糧				SEM	P值
項目	CT	BM	BP	BMP	SEM	P值
嘌呤濃度
回腸	6.17	5.62	6.58	7.46	1.38	0.81
盲腸	50.23	40.38	52.86	47.16	5.64	0.45
直腸	41.28	25.28	34.79	40.00	6.25	0.19
細菌數
乳酸菌	10.04	9.62	9.76	9.79	0.27	0.75
細菌總數	9.13a	8.05b	8.87ab	7.89b	0.28	0.01
L：E	0.91b	1.57ab	0.89b	1.89a	0.29	0.04

　　注：列行上標字母相同者表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母者表示差異顯著(P<0.05)
　　日糧CT為對照組，日糧BM為添加0.2%BioMos的日糧，BP為80mg/Kg的Zn的日糧，BMP為BioMos和Zn的混合添加的日糧。
　　L：E表示乳酸菌與細菌總數的比值
　　各處理組空腸食糜中乳酸菌數量無顯著性差異影響。但是BM和BMP組與對照組相比，減少了細菌總數(P<0.05).BMP組與對照組相比，提高了乳酸菌：細菌總數的比值(P=0.03)。
　　3.6免疫球蛋白和腸道形態
　　血清中的IgG、IgM和IgA濃度，回腸的IgA濃度和回腸的形態見表4.免疫球蛋白、回腸IgA、上皮淋巴細胞數量、在空腸杯狀細胞數量，各處理組無顯著性差異。然而，BMP組顯著的降低了隱窩深度。(P<0.04). BMP組與其他的組相比，顯著的提高絨毛長度：隱窩深度(P<0.05).
　　表4：斷奶后14d，仔豬血清、回腸中免疫球蛋白的濃度和空腸的組織形態

項目	日糧				SEM	P值
項目	CP	BM	BP	BMP	SEM	P值
血清
IgG	25.50	20.97	25.10	13.88	4.142	0.26
IgM	4.40	5.44	6.81	5.05	0.853	0.32
IgA	0.82	1.43	1.48	1.05	0.255	0.34
回腸食糜g
IgA/DM	1.47	2.01	1.72	1.94	0.470	0.85
IgA/CP	6.19	8.29	7.04	7.42	1.670	0.84
空腸
C，μm	281.3a	241.60ab	240.10ab	234.50b	11.980	0.04
V，μm	338.5	340.80	328.50	335.10	19.420	0.97
V：C	1.23b	1.41ab	1.40ab	1.46a	0.060	0.05
L：E	4.64	3.60	4.66	5.16	0.940	0.69
CG：E	17.56	15.33	15.70	15.51	1.071	0.44
VG：E	3.36	3.35	3.83	2.91	0.604	0.76

　　注：列行上標字母相同者表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母者表示差異顯著(P<0.05)
　　日糧CT為對照組，日糧BM為添加0.2%BioMos的日糧，BP為80mg/Kg的Zn的日糧，BMP為BioMos和Zn的混合添加的日糧。
　　C表示隱窩深度;V表示絨毛長度;L表示淋巴細胞數;CG表示隱窩杯子細胞;VG表示絨毛杯子細胞;E表示100個腸上皮細胞
　　4.討論
　　大量研究表明甘露寡糖可以提高斷奶仔豬的生產性能。(Dvorak和Jacques，1998;Davis等，2002，2004a)。目前，在斷奶仔豬飼喂BioMos的54個不同的試驗證實4.12%的試驗說明提高ADG，2.11%的試驗說明提高ADFI和2.29%說明的試驗提高G：F(Miguel等，2004)。Carlson等(2004)報道，在斷奶仔豬日糧中添加有機鋅，不能提高動物的生產性能。然而，其他的試驗證明，螯合鋅可以提高青年豬的生產性能(Mullan等，2002，2004)。本試驗中，甘露寡糖或螯合鋅與對照組相比，提高了仔豬的G：F，可以提高動物前期的生產性能。我們不能證明甘露寡糖和螯合鋅兩者的混合可以提高動物的生產性能。Le Mieux等(2003)，在一系列的試驗中，在仔豬日糧中添加甘露寡糖和ZnO得出相反的結論。
　　甘露寡糖通過改變胃腸道的微生物區系和減少腸道中的病原菌，來提高動物的生長(Newman，1994;Spring，2004)。在家禽中，甘露寡糖與病原菌在腸壁上的受體具有相似的結構，它與病原菌表面的類丁質也有很強的結合力，防止病原菌的繁殖(Spring，2003)。本研究表明，BM和BMP組與其它組相比，可以減少腸道中的細菌總數。同樣的，White(2002)報道，豬飼喂甘露寡糖時，可以減少大腸桿菌數。減少細菌總數是非常有意義的，因為它們與仔豬發生腹瀉具有相關性(Melin，2001)。乳酸菌：細菌總數的比值是衡量動物健康的常規指標(Muralidhara等，1977)，隨著這個比值越大，對動物健康更有利(Ewing和Cole，1994)。約束細菌總數可以防止和減少斷奶仔豬腹瀉(Melin等，2004)。
　　腸道食糜沒有反映細菌的數量的改變，日糧對它沒有影響。在斷奶仔豬日糧中添加MOS不能改變糞便中的PH和短鏈脂肪酸的濃度(White等，2002)。盡管非消化性寡糖被認為是短鏈脂肪酸的促進物(Kaplan和Hutkins，2000)，這些寡糖在其他未消化的碳水化合物占的比率比較小，比如非消化性淀粉或谷物類的非消化性多糖，大豆非消化性寡糖可能可以排除潛在的發酵促進物質。
　　Katouli等(1999)報道，ZnO增加腸道中微生物的穩定，通過減少大腸桿菌的多樣性，但是對大腸桿菌總數沒有影響。Jensen Waern等(1998)也報道對大腸桿菌數量沒有影響，在斷奶仔豬中添加2500mg/Kg的ZnO對埃希氏菌屬和腸道球菌沒有影響。缺乏藥理學濃度的Zn直接對特殊細菌數量的影響的研究，這樣就造成很難認為Zn(來源于有機鋅)在低濃度的情況下，可能直接影響腸道微生物。
　　斷奶仔豬挑戰抗原、新的日糧并建立腸道微生物。在機體，仔豬利用母源IgA控制特殊的病原菌繁殖(Kelly和King，2001)。在斷奶期間靠免疫體系來維護腸道的消化和吸收功能(Bailey等，2001)。斷奶應急使仔豬腸道絨毛萎縮，增加隱窩細胞，從而降低絨毛長度：隱窩深度的比值(Miller等，1986)。
　　Ferket(2002)報道，添加0.1%BioMos，對絨毛長度無影響，但是降低了隱窩的深度和絨毛長度：隱窩深度的比值。Iji等(2001)也表明，在家禽中增加了絨毛長度：隱窩深度的比值，因為絨毛長度比隱窩深度增加的更多。BioMos對腸道形態的改變可能是由于減少了細菌總數，但是也可能是其它的原因。
　　Davis等(2004b)研究表明，在斷奶仔豬中添加BioMos會改變白細胞數量。Swanson等(2002),表明在狗的日糧中添加MOS和果寡糖顯著的提高IgA水平。Judoh等(1999)報道，在貓的日糧中添加MOS，可以提高排泄物的IgA水平。在機體中分泌的IgA抑制細菌抗原的表達和對粘膜的免疫性具有非常主要的作用。因為它可以抑制細菌和毒素的在機體的附殖。(McKay和Perdue，1993)。調節免疫系統預防突發性的免疫反應，可以提高動物的生產性能。在本試驗沒有免疫學參數發生變化，可能是免疫指標微薄的變化。
　　補充Zn對腸道形態和機體的影響，Li等(2001)報道，在豬中添加高劑量的Zn可以提高絨毛長度和降低隱窩深度。Carlson等(1999)研究表明，增加了斷奶仔豬粘膜細胞對ZnO的反映，Zn的作用在RNA-DNA細胞增殖和MT的增殖的動態平衡中，增加了細胞的增殖和蛋白質合成。這樣就可以解釋增加了絨毛長度：隱窩深度的比值。同樣的報道，Carlson和Poulsen92003)報道，在斷奶仔豬日糧補充ZnO，增加粘膜的MT量。結果表明：在本試驗中，血清中的免疫球蛋白濃度無顯著的影響。動物飼喂有機鋅顯著的提高回腸的重量，這可能是發展免疫球蛋白的來源。
　　結論：BioMos和螯合鋅提高前期斷奶仔豬的G：F。BioMos減少空腸中細菌總數，和螯合鋅增加回腸的重量(P=0.08)。添加BioMos和螯合鋅兩者的混合物顯著增加了絨毛長度：隱窩深度的比值。