飼用植酸酶活性的測定——分光光度法》新舊國標變化及解讀

牧馬祁連

由于植酸酶在配合飼料中的混合均勻度相對較差，飼料原料配方的復雜性、差異性會干擾添加植酸酶的配合飼料酶活檢測結果的準確度、精確度及穩定性。5.5.3 對于加酶飼料樣品中酶的提取新標準中規定：“使用超聲波溶解器上超聲溶解15min，再放入回旋式振蕩器中振蕩30min。

從2009年10月1日起，GB/T 18634-2009《飼用植酸酶活性的測定——分光光度法》標準正式實施。 　　隨著植酸酶的大規模應用，飼料企業如何選擇和鑒別植酸酶產品的問題，已經成為使用者的當務之急。在眾多影響使用效果的因素中，產品本身的原因主要包括酶的種源、含量、溫度穩定性、容重、pH特性及體內水解效率等，其中酶活含量是最重要的質量指標。 　　GB/T 18634-2002《飼用植酸酶活性的測定——分光光度法》是在參考了AOAC方法的基礎上制定的，在國標頒布之初，由于市場上的植酸酶菌種相對單一，國標檢測方法具有普遍的代表性，對植酸酶的生產、應用和檢測起到了很好的指導作用。隨著植酸酶的逐漸普及，特別是在2004年以后，國內對植酸酶的研究開發進展迅速，有大量采用不同菌種發酵的植酸酶相繼問世，GB/T 18634-2002在檢測新型植酸酶產品上顯現出缺陷和不足，直接影響到檢測結果的準確性。這次標準的修訂為植酸酶的制造、貿易、應用甚至糾紛仲裁、以及加酶飼料的質量控制和檢測方法的統一都提供了充分的依據，也是植酸酶發揮效果的基本前提。下面結合生產檢測實際 ，談談新舊國標的主要區別： 　　1 縮小了方法的適用范圍 　　新標準（GB/T 18634-2009，以下同）適用范圍刪去原國標（GB/T 18634-2002，以下同）中規定的“添加有植酸酶的濃縮飼料和添加劑預混合飼料”。修訂為：“本標準適用于飼料添加劑用植酸酶產品、也適用于添加有植酸酶的配合飼料”。 　　預混合飼料、濃縮飼料中金屬離子濃度高，成分復雜，對樣品干擾大，隨著樣品保存時間的延長，酶的活性很不穩定，用現行的提取條件不能將酶活提取完全，檢測結果不準確。因此，新國標適用范圍中去掉了“添加劑預混合飼料、濃縮飼料”，保留“添加劑用植酸酶產品、配合飼料”。后兩類產品按照新標準的方法檢測均能達到較好結果。 　　2 調整了最低檢出限量和添加植酸酶的配合飼料樣品兩次試驗的允許差 　　方法最低定量限由原標準的“90U/g”調整為“130U/g”。擴大了添加植酸酶的配合飼料樣品兩次試驗的允許差，由原標準的“≤10%”調整為“≤15%”。 　　由于植酸酶在配合飼料中的混合均勻度相對較差，飼料原料配方的復雜性、差異性會干擾添加植酸酶的配合飼料酶活檢測結果的準確度、精確度及穩定性。盡管此次標準在最低檢出限量和試驗允許差這兩方面做了調整，但并不能從根本上提高添加植酸酶配合飼料樣品酶活檢測的準確度、精確度。實際檢測過程中，我們發現不同化驗室間對添加植酸酶配合飼料中植酸酶檢測結果存在較大差別也是一種較為常見的現象。 　　3 刪除了相對法 　　原標準中絕對法是不借助中間物質和步驟，直接使用烘至恒重的磷酸二氫鉀作為基準物繪制工作標準曲線，測定植酸酶含量。但是方法本身先天的因素造成測定精度低。為了保證準確度，必須加大測定的重復數，靠取平均數的辦法獲得可靠的測定值。所需時間長，費用高。絕對法適用于法定的質量認證及仲裁機構標定植酸酶標準品含量，為一般單位常規提供基準物質。相對法是借助已知準確含量的植酸酶標準對照品作為工作標準曲線，間接獲得樣品的植酸酶含量。相對法結果的準確性對標準品質量的依賴性較大。其測定結果精度高，速度快，費用低。高精確度是通過精確測定條件來達到的。適用于一般有日常測定需要的機構、企業使用。由于精度高，減少了重復次數，可以增加同一測定批次的樣品數。兩種方法的根本區別就在于對照品不同。 　由于相對法使用的植酸酶標準品不易確定和不易采購，新標準刪除了相對法，但由于絕對法對環境、設備條件要求較高，為了降低不同化驗室間檢測結果的誤差，必須使用新標準8.2.2中的建議：“在測定樣品時附加一個已知活性的植酸酶參考樣，便于檢驗整個操作過程是否有偏差。”對于在國內使用的植酸酶參考樣應在獲得國家權威質量監督部門授權的國家級實驗室間進行重復測定；如果是在國際范圍使用的植酸酶參考樣，則要在不同國家的權威實驗室間進行重復測定。 　　4 改變了緩沖溶液的配制方法 　　4.1 標準中使用無水乙酸鈉代替原標準中的三水乙酸鈉 　　4.2 用曲拉通X-100和牛血清白蛋白代替吐溫20做為增溶劑 　　因吐溫20只對少數一兩類特定的植酸酶浸提效果較好，但由于目前市場銷售的植酸酶菌種和生產工藝的不同，各單位檢測中使用的玻璃器皿質量的不同等原因，使得大部分植酸酶使用吐溫20增溶效果較差，檢測中部分植酸酶會附著在容量瓶和試管壁上，因此，用曲拉通X-100和牛血清白蛋白（BSA）代替吐溫20作為增溶劑配制緩沖液，檢測結果重復性較好。 　　5 其他區別：細化了測定過程中的操作步驟 　　5.1 明確了植酸鈉的相對分子質量和純度，細化了溶液的配置 　　底物溶液的配制中新標準規定：先用冰乙酸調節pH值5.5±0.01后，再定容。以上步驟有效確保了植酸酶酶活定義規定的植酸鈉濃度為5.0 mmol/L和pH為5.5的反應條件。 　　5.2 緩沖液和植酸鈉溶液pH調節由原標準中使用“鹽酸調節”修訂為使用“冰乙酸調節” 　　5.3 細化了試樣的制備 　　新標準中對固體樣品和液體樣品分別進行了描述。 　　5.4 對制做標準曲線的稀釋順序進行了調整 　　新標準中標準溶液的配制使用了由低向高進行配制的方法，更好的確保標準溶液濃度的準確性。 　　5.5 細化了試樣溶液的制備過程 　　5.5.1 新標準對酶制劑樣品中酶的提取和加酶飼料樣品中酶的提取分別進行了描述。 　　5.5.2 原標準中對于酶制劑樣品中酶的提取僅使用“在磁力攪拌器中高速攪拌30min”提取方式，新標準增加了酶提取的新方案：“超聲波溶解器上超聲溶解15min，再放入回旋式振蕩器中振蕩30min。”用這兩種提取方式均可達到檢測要求。 5.5.3 對于加酶飼料樣品中酶的提取新標準中規定：“使用超聲波溶解器上超聲溶解15min，再放入回旋式振蕩器中振蕩30min。” 　　5.5.4 在使用磁力攪拌器進行提取的方式中，新標準規定了“先定容再放磁力棒”的操作順序。此方法確保了試樣濃度的準確性。 　　這次標準的修訂充分說明了行業主管部門對植酸酶質量監督的高度重視 ，也是為了適應當前植酸酶行業出現的新發展，更好地維護廣大消費者的權益，對植酸酶生產企業來說則有利于實現公平競爭條件下的優勝劣汰。新標準的出臺為更科學地評價、檢測和使用植酸酶提供了較好的指導作用。

zhou7550

這個復制下載學習了，謝謝樓主解讀