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人工授精最佳方案的重點應放在排卵的相對時間的掌握及對公豬的有效利用 華中農業大學牧醫學院動物病毒室 王貴華 前言 豬場中的最佳授精方案主要是降低授精量而不降低繁殖力。當在排卵前24小時期間進行授精時，高質量精液的授精可獲得好的繁殖力。然而，因為母豬排卵時間不能在24小時內預知，所以，縱使清楚這個最佳時間，但為了得到最佳授精效果，這段時間和/或排卵時間的預測還是需要改進的。有關授精的時間安排——發情周期的相對特征和繁殖力（母豬產仔率，一窩產仔數）的關系已在六十年代和七十年代就進行過研究。九十年代早期以來，超聲波已應用到自然排卵母豬排卵時間的預測上。實驗中，根據母豬行為和生理學方面的變化進行母豬的排卵時間安排及授精方案對受精的影響，完善了現有知識。而且，授精時間的安排，授精期間環境對授精的影響至關重要。此外，本文還提及了關于公豬出現對子宮運動作用的最新資料（Langendijk,2001），以及授精和排卵期間的最佳時期。 排卵后卵的壽命以及能引起授精的足夠數量精子的壽命，決定了輸卵管中成功受精的排卵相對時期（Hunter,1994）。六十年代已經開展的研究表明，發情周期中授精相對較早或較晚的母豬的受精率嚴重下降。（Hancock和Hoveu,1962），而且母豬產仔率和一窩產仔數下降亦很大。（Willemse和Boender，1967）。從這些實驗看出，因為排卵時間隨發情周期變化很大，因此對精子壽命和發情周期是很難下結論的（Soede和Kemp，1997）。所以在這些實驗中，通常使用人工排卵的小母豬來研究受精過程（例如，Dziuk,1970;Hunter,1967;Hunter,1981;Hunter et al.,1987）。這些實驗都表明：精液的運輸、精子細胞的獲能和精液量的多少均對授精至關重要。 近幾年來，有關自然排卵的相對受精機會的研究已有報道。研究發現，在一些母豬中，當在排卵前40小時到排卵后16小時之間進行授精（30億精子細胞用量）時，受精效果理想（Soede et al.,1995a）。然而，要使多數母豬都取得理想的受精結果，授精則須在排卵前12小時（Waberski et al.,1994a）或24小時期間（Waberski et al,1994b;Soede et al.,1995ab;Steverink et al.,1997）進行，見圖1。 以30億精子細胞做為一個授精劑量進行授精后，受精率因排卵的可變間隔可分別為0%、1-20%、21-40%、41-60%、61-80%、81-99%和100%（摘自Soede et al.,1995ab和Steverink et al.,1997）。從以上結論可看出，當在排卵之前進行授精，受精結果最佳。在排卵前0~24小時內，多數母豬受精率達100%，在這個時段之外，部分受精的母豬的百分比和沒有受精的母豬的百分比均有所升高。基于母豬產仔率和一窩產仔數，授精和受精之間的最佳間隔可以更長一些，可在排卵前28小時至排卵后4小時之間進行（Nissen et al.，1997）。而事實上大約24小時的間隔會導致受精率下降，這意味著多數母豬中，大多數精子的受精壽命被限制在24小時內。在排卵之前進行授精會導致受精率的下降，這就是說，卵母細胞的受精壽命大約和精子與之結合并到達受精位置的時間相近似。然而，即使是在最佳時期內，仍有部分母豬受精不理想，甚至沒有受精（見圖1）。 近來，有關何時授精才能獲得最佳受精結果這一問題，已做了大量的試驗。下列各項影響因素已得到調查： 1．貯存過程中精子老化；雖然授精時精子超過38小時并不影響結果（Soede et al.,1995），但使用老化精液縮短了授精的最佳時期（Waberski et al., 1994b）。 2．稀釋液；精液貯藏對授精最佳時間的負影響主要取決于采用的稀釋液（Waberski et al.,1994b）。 3．精液量；精子是從10億到60億幾乎不能影響授精的最佳時期。 4．冷凍精液；使用冷凍精液時，要在授精最佳時期排卵前0~4小時進行。 5．精液回流；只有在精子量少（10億）授精和回流超過20ml（共80ml時）授精時的精液回流，才會影響受精。授精后的精液回流對受精沒有影響（Steverink et al.,1998）。 總之，從上面可以看出，是到達輸卵管的精子數量和/或質量降低的因素，縮短了最佳受精的授精時間。可以推斷，在排卵前0-24小時進行授精，使用高質、最多2日齡的精子，可以使受精率大為提高。但奇怪的是，即使授精量加倍，也很難獲得理想的效果。 近來的實驗表明，完全可以提高精子運動和/或存活率，其可能性如下： 1．提高精子質量？ 除了運動性，精子的一些體外因素也與體內受精結果有關（Colenbrander,2000）。近來，研究發現，（公牛和公豬）精子細胞有與透明帶或透明帶蛋白結合的能力。Harkema et al (1998)發現，經3小時培養，血管內液中與透明帶蛋白結合的公豬精子細胞（可能是獲能精子細胞）的比例達到最高峰。高峰的水平隨公豬個體而變化極大（Harkema et al,2002）。四頭公豬的精子經3小時培養后，分別有31%、40%、45%和53%的精子與透明帶蛋白結合力增強，體內卵母細胞受精率（排卵后用5億精子細胞立即授精）平均為77%、82%、87%和94%，有40%、62%、67%和83%的母豬的卵細胞與精子的受精率達100%。（Harkema et al,2002）。因此，公豬精子細胞體外獲能的差別與體內受精結果密切相關。這種正相關性是否在排卵前而非排卵后授精時發生值得探討。如果體外透明帶結合率與體內精子細胞受精壽命存在相關的話，公豬的平均受精率可能相近，這將使之不能成為公豬選種的有效工具。然而若將不同公豬精子進行選擇性混合可能有助于受精。 2．減少精子細胞吞噬量？ 精子授精后1小時內不能到達輸卵管，主要是由于細胞的吞噬作用。Rozeboom et al (1999)發現授精過程中精漿的摻入引起白細胞流入子宮腔的比率改變。資料進一步表明，授精方式影響白細胞對精子的吞噬作用。（Woelders,2001）。因此，對白細胞的流入量和其對精子細胞的吞噬進行調控可以改變到達受精部位的精子數和受精比率。 3．授精過程：進行子宮的（深部位）授精？ 特別是在精液昂貴的時候，由于精子數量較少，因此授精過程非常重要。（例如，有特定遺傳基因組成的公豬精液）。在西班牙（Martinez et al.,2001）和德國（Rath et al.,1999）實驗室已經研究出了子宮深部位授精程序。用5千萬精子進行授精，成功引起母豬懷孕。農場試驗中，在子宮頭蓋部進行授精（非子宮深部）。這表明此項技術允許精液量減少到10億（Waston 2001）。然而，目前的子宮授精技術的弱點在于僅對老的同等母豬的限制性使用和缺乏技術熟練的授精人員不易掌握。 4．母豬的特征？ 品種不同，卵母細胞繁殖壽命也不同（Kemp和Soede,1997）。但是，對可能影響母豬的諸如獲能比率、子宮的運動、精液的傳送或精液在生殖區的生存等方面的因素仍知之甚少。然而，最近已有資料報道影響子宮運動性的因素（見下文）。 總之，在母豬的生殖腔中，進一步提高精子的傳送和生存能力有諸多可能性。這些進步將使授精量減少或不太理想條件下（精液老化，授精人員不熟練）提高受精率。在這方面，授精時公豬出現顯得非常重要（見下文）。 排卵時間的預測標準： 排卵基本上開始于發情后35到45小時之間（公豬出現后的靜立反應）。然而，母豬間的差異是很大的。比如在10~85小時之間（Weitze et al.,1994）或10~58小時之間（Soede et al.,1995a），即使有時沒發現差別。另外陰道的溫度和陰道內粘液潤滑性也不是排卵時間的理想預測標準（Soede et al.,1997;Stokhof et al.,1996）。 九十年代，在德國、荷蘭、瑞士、丹麥的調查中，一般排卵時間安排（發情比例）在64~72%之間變動（Soede和Kemp,1997）。發情持續時間（也就是母豬在見到公豬后發生的靜立反應的一段時間）在排卵時間的50-60%之間變動。因此，發情持續時間看起來是發情時對排卵時間的最好估計指標。但發情持續時間極易發生改變，對排卵時間只能提供回顧性的估計指標。所以，研究應致力于尋求其它用于排卵時間安排的預期估計指標。 在發情期間，母豬對所采取的促進發情的刺激所作出的反應先增強后降低（Willemse和Boender,1967）。這就是說，發情的早晚期，母豬對強烈刺激（如交配區探查或公豬的緊密接觸）作出反應。當處于發情中期時，其對較低強度的刺激也能作出反應。（如公豬不在時進行壓背法）。在發情期間，通過不同強度的刺激，可以區分出不同的敏感期（如公豬不在時對壓背法的敏感性，公豬與其以柵欄相隔時對壓背法的敏感性，或進行交配區探查時對壓背法的敏感性）。Langendijk et al.,（2000b）進行了發情探查時不同強度的刺激可否區分更多的反應時期和是否能用于更精確的排卵預測兩方面的研究，但結果并不理想。大多數母豬在發情期對低強度刺激根本不表現出靜立反應。因此，不能區分發情期不同的反應時期。而且，即使發情時母豬表現出更多的反應時期，這些時期也與排卵時間聯系甚少。 多參數（體質和行為方面）的結合對排卵時間的估計可能比單一參數效果好。Langendijk et al （1999b）最近進行了一次嘗試，他把母豬內陰的潮紅溫度與發情行為特征結合起來。母豬開始發情時，陰部變紅的母豬大約占60%，其一般在排卵前18小時由潮紅變為粉紅，并且始終在排卵前36小時和排卵后2小時之間變動。在研究中，雖然沒有檢測到激素，但陰部由潮紅到粉紅的變化可能與發情變化有關。如果這些結果正確，那么那些在發情開始內陰戶就潮紅的母豬沒有必要在陰部潮紅消退前進行授精，這樣精子就得到合理的利用。 若排卵時間取得最終的預測，那么就可以用簡單的方式來控制催乳激素的上升或激素結合物的下降。但對豬來說，這是不切實際的。不久的將來，母豬發情周期的推測勢必應著眼于排卵時間的預測。 建立更有效的授精方案： 發情行為的變化以及相關的排卵時間的低預測性使得在排卵前最佳時期母豬的一次性授精更為困難。因此，大多數母豬在發情期間要重復多次授精。目前的問題是重復授精是否應在12~24小時之間進行。Lemberson和Safranski（2000）結合每天1~2次發情檢查的結果對不同授精計劃做過經濟上的比較。在他們的模型中，懷孕的幾率大于90%（排卵期間進行授精），而在排卵前24小時和排卵后6小時進行授精時，幾率降低到62%，發情后40±12h，發生排卵，從斷奶到排卵的時間在136±18h左右。應用這些參數，在12小時期間進行授精，經濟回報最高。在發情后12、24和36小時，每天進行2次發情檢查，在發情后0、12、24和36小時，每天進行一次檢查。這些都是在排卵前的12小時內進行授精所見到的受精率邏輯上的結果（相對較低）。德國豬場的調查結果表明，每12小時進行一次授精的畜群，其繁殖力并不比每24小時授精一次的畜群好。（VFV，1999）。相似的是，Castagna et al.,（2001）和Thorup（2001）也從他們的試驗中得出結論，認為，每隔12小時和24小時進行授精，其繁殖力相近。后來的結果比以前提及的授精試驗的結果（Waberski et al.,1994b;Soede et al.,1995；Nissen et al.,1996;Steverink et al.,1997）更清楚反映了每24小時進行授精是充分的。可是，諸如技術不熟的授精人員（Flowers,1994）或精子老化（Waberski et al,1997）等因素可能會縮短授精間隔時間。 過頻的授精不僅浪費精子、勞動力和金錢，還有很多負面影響。Rozeboom et al（1997）在發情前后進行再次授精降低了母豬產仔率和每窩產仔數。De Winter et al.，（1992）認為在發情前后進行授精，其子宮受感染機會遠大于發情早期和中期。這種現象與發情率有關，影響血流量和白細胞匯集以及子宮的收縮。 因此，過度集中的授精措施，會導致繁殖力下降，這與發情前授精引發感染有關。 恰當的運用發情周期 因為排卵較為固定的發生在發情的2/3時期，因此，發情周期的推斷既是排卵的間接推斷，又是授精最佳時間的推斷。可是發情周期變化異常，受多方面因素的影響，例如，畜舍的條件，緊張程度，季節，平等性，基因背景等（Soede和Kemp,1997）。不過在一定范圍內，發情周期的推測是可能的。首先，雖然不同的豬場平均發情周期變化很大（31~65小時），但對同一豬廠，月與月之間是一致的（Steverink et al.,1999a）。這表明，發情期授精的最佳時間因豬場的不同而有變化。再次，發情周期與斷奶—發情間隔（WOI）密切相關。（Rojkittikhun et al.,1992,Weitze et al.,1994;Kemp和Soede,1996）。通常WOI短的（3-4天）母豬發情周期長。這與排卵時間提前有關（Weitze et al 1994;Kemp和Soede,1996）。Steverink et al（1999a）發現在54家豬場中，有43家WOI和發情周期的關系非常密切，約占80%。因此，在多數豬場，WOI為6天的母豬應在發情剛剛開始后不久就進行授精，以確保在排卵之前進行初次授精。表1闡述了平均發情周期不同的兩家豬場，其發情周期與最佳授精時間的關系（Steverink et al 1999b）。這些數據均來自豬授精方案模型（PIGSIS；Steverink 1999）。模型證實了初次授精時間很容易太晚，特別是在發情周期短，母豬WOI為5-6天的豬場。初次授精過早并不是個大問題，可以再次授精，但應避免在發情過后授精。因此，為了深入了解授精方案的有效度（以及發情檢查的質量），場主們應建立發情周期表，還應把WOI對發情周期的影響考慮在內，以便對母豬個體授精時間安排的最佳化進行檢測。 表1. 對一個平均發情周期為36-60小時的豬場，與排卵有關的初次授精的時間安排，用PIGSIS模擬。在兩個豬場，在發情開始后24小時進行授精，每24小時，WOI就上升，同時伴隨著發情周期下降6小時。 WOI(天) 1．過早：發情前超過24小時，太晚：發情后。 2．PIGSIS：PIG Simulation model for Insemination Strategies (Steverink,1999)。 定時人工授精： 為了提高排卵時間的預測準確性以及定時人工授精的可行性，可采用異種激素（eCG,hCG或GnRH）。但是否成功主要取決于管理措施（Brussow et al.,1996）。激素的應用可能掩蓋了管理上的不善，而且耗費大，在不久的將來，一些國家（歐盟）會相繼取締促排卵激素的使用。 授精時公豬的出現可刺激子宮的收縮： 除了授精時間，授精條件對受精成功與否也至關重要，這與外界對子宮收縮的影響有關。最近報道了授精時公豬出現對子宮收縮的影響。 交配中，精子經子宮頸內輸精，通過雙子宮角到達輸卵管。（Viring,1980）。特別當授精時間不太理想時（例如，排卵前后時間太長），精子快速運動到子宮輸卵管結合部就顯得十分重要。子宮肌收縮就具有將精子細胞從子宮體轉運到輸卵管的功能。因此，子宮收縮有助于受精成功。圖2是關于一頭典型母豬在繁殖循環的不同階段子宮收縮運動的情況。 同大多數哺乳動物一樣，母豬在發情期子宮肌收縮加強（圖3，Langendijk,et al.,2001a）。雖然在Langendijk et al(2002a)研究中，所有母豬在發情中子宮收縮加劇，但母豬個體間的差異是存在的。收縮頻率在6-40h-1之間，收縮幅度在16-57mmHg之間變動。這些不同在發情斯持續存在。例如，發情前幾天中，子宮運動較差的母豬，因為精子運動不佳而致使受精率降低。從Soede（1993）的文章中可以看出，授精時公豬的刺激，可以影響繁殖過程，例如精子運動進而影響受精，除外界的刺激（例如嗅覺和觸覺刺激），內部刺激（精漿或其組成成分）也同樣重要。本文僅討論外界公豬刺激對母豬受精的影響。有關精漿成分或精子對受精的影響可參見Laus（1990）和Waberski（1997）的文章。 公豬刺激促進催產素的急劇釋放，從而影響子宮收縮運動。催產素可刺激平滑肌，子宮肌對催產素敏感。發情中，刺激引起催產素釋放量減少（Sheldrick和Flint,1985）。Langendijk(2001)研究了母豬發情期間，不同公豬的刺激對催產素釋放的影響。在他們的研究中，分別比較了壓背法，公豬外激素噴灑與壓背法相結合和公豬在場壓背法三種方法。 不管是否使用公豬外激素噴灑，壓背法對催產素的釋放毫無影響，但公豬的刺激可引起催產素急劇釋放（Langendijk,2001）。自Mattioli et al（1986）發現用公豬外激素噴灑可引起催產素釋放以來，其可行性就從未被懷疑過。Mathiasen（2001）在試驗中發現，盡管公豬與母豬僅一墻之隔，但若僅靠壓背法，仍不能促進催產素釋放。他進一步指出，再用與公豬鄰舍的母豬作研究，人工刺激（壓背法結合腹股溝及溝下區刺激）可以促進催產素的釋放，但低強度的刺激（較少刺激）對催產素釋放作用并不明顯。Langendijk（2001）也研究了發情期間，不同公豬刺激對子宮收縮運動的影響。公豬的出現和觸覺刺激僅僅引起收縮頻率和幅度的輕微增強。子宮自發收縮運動較弱（50%母豬收縮頻率小于26h-1），同觸覺刺激和外激素刺激相比，公豬的出現明顯增強了子宮收縮頻率(<0.05)。因此可以認為授精時，公豬出現可以使未接觸刺激前運動較差的子宮收縮加強。 人工授精能促進子宮收縮嗎？Claus和Schams（1990）發現，授精導管插入后，無催產素釋放，Langendijk et al（2002a）研究發現子宮內注射生理鹽水也不能促進子宮收縮。但最近研究表明，用80ml的授精量進行授精可使子宮收縮頻率增加50%。在交配中用交配夾模擬刺激母豬肋部，也不能促進子宮收縮。在子宮頸內有規律地移動導管5分鐘，也同樣不能促進子宮收縮。總之，資料表明，授精時公豬出現對子宮收縮較差的母豬來說，可以起到積極的作用。壓背法，交配夾模擬法或壓背外加公豬外激素噴灑均不如公豬出現效果好。因此，用公豬刺激母豬是明智的選擇。 表2. 授精（40ml，5億精子量）前10分鐘，40ml鹽水加1mg前列腺素進行宮內注射對精液回流量和受精結果的影響。（引自Langendijk et al 2002b） 1 動物回流類型的分布因處理方法不同而存在差別（P<0.05） ab P<0.05 除了催產素，前列腺素也可刺激子宮肌運動。田間試驗中，特別是當條件不太理想時，例如授精人員操作不熟練（Flowers,1995）或精液老化（Flowers,1996）或夏季不育時（Pena et al 1998a,b），授精時注射催產素或前列腺素，可提高繁殖力（Levis,2000）。 但子宮收縮刺激過度也會降低繁殖力（Langendijk et al 2000b，見表2）試驗中，用40ml鹽水或外加1mg前列腺素的40ml鹽水在授精（40ml，5億精子量）前10分鐘進行宮內注射。排卵用促性腺激素釋放激素（斷奶后85小時，50ug）計算時間，在預期排卵（一般為促性腺激素釋放激素注射后40小時）前20小時進行授精。表2體現了對精液回流和受精結果的影響。前列腺素對子宮收縮作用出現的早，但目前發現其致使回流量增加，從而降低了受精率。顯然在不過分影響精子運動和受精結果的基礎上控制了宮收縮的刺激是可行的。研究發現，前列腺素對所有母豬都有子宮收縮促進作用，而與其自發的子宮運動無關（Langendijk,et al 2002a），但催產素（注射（5IU）或公豬出現）對自發運動較差的母豬特別有促進作用。因此，只要刺激量不過度，對子宮收縮還是有所幫助的。在這方面，公豬出現和低水平催產素刺激是促進子宮收縮的安全途徑。 結束語 有效的授精方案（減少發情期授精次數）的制定一方面取決于授精勞動力、授精量或公豬的消耗上，另一方面取決于發情檢查的勞動力消耗。各消耗間的平衡可以改變，例如冷凍精子的應用、或具有特殊基因組成的精子的應用，可能要求更有效的授精方案。因此，科研主要集中于最佳授精時期的范圍和排卵時間的預測上，以及精子細胞到達受精部位的有效傳送上。 從文中可以看出，公豬在發情檢查上的應用以及授精時公豬刺激母豬是明智之舉。總的來說，若僅用公豬刺激器具（壓背法或公豬外激素噴灑），其效果比公豬親臨現場要差。公豬的刺激效果也可能因個體間的差異而略有不同。 許多事實證明了母豬發情期間公豬出現的作用（Soede和Kemp，1997）。至少幾月齡大小的公豬可以引起小母豬的發情（Kirkwood和Hughes，1980）。在行為方面，公豬比母豬更主動，熱情。Turner et al（1996）發現，公豬的性行為水平不影響對切除卵巢的小母豬進行壓背法誘導發情檢測的效果。公豬性沖動可以用交配試驗中的交配次數和交配前的反應時間來計算。那么，人們也許會問這個參量是否是發情檢測中公豬選擇的一個確切的指標？這還有待于進一步的研究。
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