解析豬瘟免疫失敗的主要原因

畜牧人編輯部3 · 發表于 2013-7-12 09:24:47

豬瘟是嚴重危害我國養豬業最重要的傳染病之一。OIE 制定的《國際動物衛生法典》( 2002 年版) 仍將其列為 A 類法定報告傳染病之一。歐美等發達國家通過疫苗免疫、撲殺等綜合防制技術措施已消滅了豬瘟。在我國五十年代中國獸藥監察所方世杰、周泰沖、李繼庚等選育了一株適應家兔后對豬基本無毒力, 但卻保持良好免疫原性的弱毒疫苗株——中國兔化弱毒疫苗株, 國外稱為 C 株, 同時建立了凍干技術。因其具有免疫力強、保護率高且持久、遺傳穩定、無殘余毒力等優點, 是國際上公認的效果最好的豬瘟弱毒疫苗, 由此獲得國家發明一等獎, 該研究曾為我國乃至世界許多國家豬瘟的防制起到了關鍵的作用。

但是近 20 年來, 我國豬瘟的流行形式和發病特點已經發生了很大的變化, 尤其是妊娠母豬帶毒綜合征、仔豬胎盤垂直傳播及先天免疫耐受, 同時還存在其他多種非典型的發病特點。在出現這些現象的地區和豬場往往同時表現無法解釋的免疫失敗, 對我國養豬業出現的這個重大問題和難點問題, 國家已投入相關項目進行研究, 并取得了一些較新的研究進展, 綜述如下。

1、豬瘟持續感染對疫苗免疫的影響

1. 1　母豬持續感染與垂直傳播　母豬持續感染和仔豬胎盤感染是目前引起免疫失敗的重要原因。我們首次在實驗室成功地利用豬瘟野毒人工復制了豬瘟病毒持續感染的帶毒母豬動物模型, 此母豬可帶毒 750天。這種豬甚至可以終生帶毒、排毒, 可成為豬瘟病毒的主要儲存宿主, 血液中的含毒量可達105～106PF U/ m l。最早報道豬瘟胎盤感染是在 1955年, 以后此類報道逐漸增多。胎盤感染后, 引起母豬繁殖障礙,出現弱胎、死胎, 甚至木乃伊胎, 從死亡仔豬體內可分離到豬瘟病毒。為了研究持續感染母豬對仔豬的胎盤垂直傳播情況, 再將這頭母豬與人工感染另一株豬瘟野毒的帶毒公豬或健康公豬自然交配或人工受精使其懷孕產仔, 可產下帶毒的木乃伊胎和死胎,用豬瘟熒光抗體檢測胎豬均為陽性, 此后該母豬不能再次配種。為了解帶毒母豬對同居豬和環境的污染情況, 在母豬帶毒 273 天時, 用健康陰性豬與之同居, 可造成同居豬感染。至此成功地人工復制了豬瘟病毒胎盤垂直傳播及水平傳播的動物模型,在實際工作中, 這些持續感染帶毒豬的存在, 可形成豬瘟常發地區和豬瘟常發豬場。由這種母豬產下的仔豬多為先天免疫耐受豬, 這種情況常常導致豬瘟在豬場形成惡性循環, 即豬瘟亞臨床感染→胎盤感染→母豬繁殖障礙→仔豬帶毒→后備母豬→亞臨床感染。如此惡性循環, 使得帶毒豬在臨床中有 3% ～33%的帶毒率。

1. 2　仔豬先天免疫耐受　由母豬持續感染和仔豬胎盤感染引起的免疫失敗現象, 除了出現上述生產水平降低的情況外, 經胎盤感染出生后存活的仔豬往往成為持續感染者, 可長期帶毒、排毒, 其本身并不表現臨床癥狀。這種豬除了對豬場造成惡性循環外, 這種經胎盤感染的仔豬出生后, 吸允初乳, 數日內病毒血癥可一過性降低, 但病毒存在于全身上皮組織、淋巴樣組織和網狀內皮組織, 這種感染豬不能建立中和性抗體應答, 形成免疫耐受, 以至于對疫苗免疫后不能產生免疫應答。L iess用低毒力的野毒Glento rf株給妊娠40、70、90 天的母豬滴鼻感染, 結果引起母豬繁殖障礙, 仔豬出生后多為死胎、木乃伊胎、流產, 或出生后在 1 周內到 11 周內死亡, 出生后存活的發病豬無臨床癥狀, 剖檢為胸腺萎縮、淋巴結腫大。由此證明了持續感染帶毒母豬所產仔豬對疫苗免疫后不能產生保護作用的免疫耐受機制。

另外, 我們模擬生產中的實際情況, 對無臨床癥狀的豬瘟陽性經產母豬所產仔豬進行免疫效力試驗研究。兩頭母豬分別產下兩窩仔豬, 帶毒率分別為5/ 11和 12/ 14, 產仔時按仔豬產出順序隔頭進行臨時豬瘟兔化弱毒疫苗接種, 1 h 后再吸初乳, 再用標準石門強毒進行攻擊。免疫豬瘟疫苗不能使帶毒仔豬產生免疫保護力, 接種疫苗的 5 頭豬在強毒攻擊后死亡4 頭。結果: 豬瘟病毒持續感染對胎兒發育有不同程度的影響; 豬瘟病毒持續感染母豬可經過胎盤垂直傳播病毒給仔豬, 攻擊前死亡的豬全是帶毒豬; 吃初乳和疫苗接種不能阻止帶毒仔豬的死亡, 并且形成免疫偏離現象或免疫耐受現象, 導致免疫失敗, 甚至誘發豬瘟, 通過此項試驗也得到了證實。通過病理切片觀察, 豬瘟病毒持續感染可導致母豬生殖器官產生病理變化, 特別是卵巢的病理變化, 使卵泡結節化, 降低或失去排卵功能, 最后導致功能障礙及繁殖障礙。

1. 3　帶毒公豬的垂直傳播　用 RT -PCR 檢測帶毒公豬自然交配所產死胎的病毒基因型, 結果表明: 死胎感染的病毒基因型與帶毒母豬原有的病毒基因型不同, 而與帶毒公豬的病毒基因型相同。試驗證明帶毒種豬不僅能通過母豬胎盤垂直傳播, 而且能通過公豬精液垂直傳播豬瘟, 這是造成豬瘟持續感染的又一重要原因。

綜上所述, 豬瘟持續感染母豬造成的垂直傳播是引起仔豬死胎、木乃伊胎、弱胎及不發病的仔豬帶毒的主要原因之一, 加之它所產生的水平傳播方式, 還會造成其他豬的感染并污染環境。因此一旦種豬場有豬瘟病毒持續感染的種豬存在, 就會引起免疫耐受,導致免疫失敗, 時刻都有豬瘟發生的危險。因此要根除豬瘟就必須從源頭抓起, 及時淘汰帶毒種豬, 對種豬場進行徹底凈化。

1. 4　從細胞水平和分子生物學水平證實豬瘟持續感染對機體的影響

1. 4. 1　豬瘟病毒 E0 基因對持續感染的影響　經研究證實, 豬瘟病毒的囊膜糖蛋白E0基因位于病毒粒子的表面, 對病毒的免疫、識別、吸附并進入宿主細胞是十分重要的。在豬瘟病毒感染的細胞中,E0蛋白是惟一可以分泌到豬瘟病毒浸染的細胞培養上清液中的糖蛋白。并可誘導機體產生中和抗體, 用 E0 免疫豬可誘導產生對致死劑量的保護性免疫反應, 同時也是病毒粒子吸附進入易感細胞的必須蛋白。在病毒粒子中, E0以分子量為 100 kD 的同源二聚體的形式存在, 但糖蛋白E0并不像E2那樣具有跨膜區, 而是以一種未知機制連接在病毒粒子的表面上, 對豬瘟病毒在細胞中的復制、表達和調控過程中起重要作用。糖蛋白 E0 既是一種包膜糖蛋白, 又是一種核酸酶, 已有研究發現, 豬瘟 E0 基因含有與地衣類及植物核酸酶同樣保守的兩個氨基酸基序 SLHGIWPG( 或 E) ( 28～36位) 和 EWNKHGWC( 75～82 位) , 基序中位于 30 和79 位的 H( 組氨酸) 為 RNase 的催化活性關鍵氨基酸殘基, 高度保守,E0蛋白的這種RNase活性已分別被試驗所證實。值得注意的是,E0蛋白的RNase活性似乎與宿主細胞凋亡有關, 重組 E0 蛋白能夠在體外誘導多個物種的淋巴細胞凋亡。

近年來 Hulst 等通過對 C 株基因組全長 cDNA中的 E0 基因中的關鍵氨基酸殘基 H 進行突變, 獲得了無E 0 RNase活性的病毒突變體, 表明該兩區域中的 H 對 RNase 活性是不可缺少的。同時還發現由此突變株建立的無 RNase 活性的突變株能導致 SK-6細胞出現細胞病變效應(CP E) ,而這種RNase活性失活的豬瘟病毒將變成一種致病性病毒粒子, 導致細胞凋亡。推測 E0 蛋白的RNase 活性可能對病毒在宿主體內的持續感染有直接關系, 而且在病毒復制過程中有可能發揮了重要作用。同時提示E0 在毒株演化中對于病毒適應宿主細胞也可能具有重要作用, 也可以E0為靶蛋白來設計新的抗病毒策略。由此推測基因在豬瘟病毒持續感染、細胞嗜性等方面發揮重要作用。

1. 4. 2　豬瘟病毒對細胞的持續感染　利用田間分離鑒定的造成懷孕母豬與仔豬持續感染的豬瘟病毒株( CSF V39、CSF V22) 分別接種 PK15 細胞, 體外連續帶毒傳代。建立了穩定的豬瘟病毒持續感染細胞模型, 獲得 CSFV39-PK15 和 CSFV22-PK15 病毒持續感染細胞株。用免疫熒光技術、RT -PCR技術、透射電鏡跟蹤監測了CSFV 39-PK15 CSFV22-PK15持續感染細胞株連續傳代過程中病毒在細胞內的存在情況。結果表明CSFV39-PK15細胞連續傳至 127代, CSFV22-PK15 連續傳至 57 代仍有豬瘟病毒存在, 表現為病毒對細胞持續感染的基本特征。在傳代過程中, 成熟病毒可以釋放到細胞外, 其相對感染量比感染原液至少低 2 個數量級。實驗還表明: 豬瘟病毒可持續感染 PK15 細胞并使受感染細胞正常代謝機制發生明顯改善, 即持續感染的豬瘟病毒隨PK15 細胞的生長繁殖而增殖, 且從被感染細胞正常代謝所需的供能物質中獲得病毒復制和轉錄所需的能量, 從而干擾了細胞固有的生理生化過程, 使細胞的正常代謝速率減慢, 形成了細胞代謝熱功率變小及相同時段內被感染細胞代謝總熱量降低等病理生理現象。此項研究為在細胞水平上研究豬瘟病毒的持續感染機理奠定了基礎, 同時也為研究國內溫和型豬瘟的發病機理提供材料, 具有理論意義和使用價值。

疫苗接種產生的中和抗體在體外對不同野毒株的中和作用表現出了很大差異, 耐受性高的毒株在血清 4 倍稀釋時才能中和, 耐受性低的毒株用 320 倍稀釋的抗血清就能將其中和。如果在體內也是這樣, 那么在機體處于亞免疫狀態的情況下, 耐受性強的毒株就有可能侵入機體潛伏下來造成持續感染。另外, 機體的免疫狀態低下也可能是造成持續感染發生的重要原因。

2　疫苗方面的因素

2. 1　豬瘟兔化弱毒疫苗的免疫效力試驗　針對目前國內對于我國 C 株弱毒疫苗的疑問也作了一些試驗研究, 在實驗室采用非免疫豬和無豬瘟病原及抗體存在的豬進行免疫保護相關性試驗, 通過試驗研究發現我國疫苗株對我國目前流行的不同毒力( 高、中、低) 、不同地域、不同分離時間以及不同基因亞群的多個野毒進行單獨、混合、交叉、一次及多次攻毒, 均能獲得完全保護。說明我國現用的豬瘟弱毒疫苗對目前流行的豬瘟野毒仍然有效, 初步證明現用疫苗的免疫原性沒有發生改變。另外法國用我國C株和T hiv erv al對慢性豬瘟病毒引起的母豬繁殖障礙均有效, 日本的GPE 疫苗株也獲得了同樣的結果。

2. 2　豬瘟兔化弱毒疫苗的分子生物學研究　

我們對國內生產豬瘟疫苗的廠家中隨機抽取部分批次的豬
瘟細胞疫苗, 共( 18 個批次) 以進行免疫基因的分子生物學研究, 對這些疫苗的E2基因主要抗原編碼序列分析表明: 所有批次疫苗的核苷酸及氨基酸均呈現較高的同源性, 均為 99. 1% ～100% ; 對 3 個廠家生產的豬瘟細胞疫苗的E0基因進行研究, 沒有一個堿基發生變異, 其 E0 基因結構的穩定性均保持在較高水平, 表明國內所使用的疫苗株E0基因處于穩定狀態, 并且其穩定性較E2基因高; 這初步說明目前我國國內生藥廠生產的豬瘟兔化弱毒疫苗基本上是穩定的, 由此證明疫苗的種毒也沒有發生變異。然而豬瘟病毒在細胞培養過程中繁殖滴度較低, 因此個別廠家豬瘟牛睪丸細胞苗存在滴度不夠, 由此影響到疫苗的免疫劑量, 個別地區存在著由此引起的免疫失敗的現象。

2. 3　非豬瘟病毒感染對豬瘟疫苗免疫效果的影響

　造成豬瘟持續感染的原因目前還不十分清楚, 經初步研究還證實: 豬瘟病毒反復多次感染及 PPV、PRV 和 PRRSV 混合感染均可造成豬瘟病毒在體內的滯留而造成持續感染。利用 20 頭 9 月齡左右豬瘟、偽狂犬病、豬繁殖與呼吸障礙綜合征抗原、抗體陰性豬, 將其分成 6 組, 分別利用豬細小病毒( PPV) 、豬偽狂犬病病毒(PRV ) 和豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒( PRRSV ) 單獨或混合感染, 7 天后, 連同對照豬 4 頭, 免疫接種豬瘟兔化弱毒疫苗( HCLV) , 13 天后連同 4頭陰性對照豬一起攻擊豬瘟石門系強毒。整個試驗期間分別每天測溫, 觀察臨床癥狀, 每周采集扁桃體和血樣做各種病毒抗原及抗體檢測。結果在攻擊石門系強毒后 2 周, 單獨和混合感染了非豬瘟病毒后接種 HCLV 疫苗的 4 個免疫組12頭豬除 1 頭外, 11頭全為HCV抗原檢測陽性, 且多呈強陽性; 而單一HCLV疫苗免疫組在豬瘟強毒攻擊后檢測不到HCV; 所有 HCL V 疫苗免疫豬均存活, 而非免疫對照組 4 頭豬全部在攻毒 16 日內死亡。試驗表明非豬瘟病毒感染的確對豬瘟疫苗免疫效果有影響, 能造成豬瘟疫苗免疫的失敗。

3　母源抗體及疫苗免疫程序對疫苗免疫的影響

模擬自然感染的亞臨床狀態和低抗體水平狀態來進行不同劑量疫苗免疫效力的研究, 通過混合感染實驗來對豬瘟免疫失敗原因進行研究, 即從病原到機體全方位進行綜合研究, 對豬瘟的防制具有十分重要的科學意義, 同時對其他產生免疫失敗的疾病具有重要的指導意義。

經研究發現母源抗體滴度對豬瘟兔化弱毒疫苗的免疫保護效力有影響, 當母源抗體滴度在 16倍時,將疫苗的免疫劑量加大到 2 到 4 頭份, 能抑制母源抗體干擾, 達到較好的免疫效果; 另外研究還顯示低水平的母源抗體不能抵抗豬瘟野毒感染, 因此及時監測母源抗體滴度, 正確地按規程進行疫苗免疫注射能確切地抵抗野毒的感染。

另外還進行了豬瘟疫苗對帶毒仔豬免疫的影響研究、人工兩次野毒攻擊對疫苗免疫效力的影響和豬瘟抗體水平與感染量關系的研究。結果帶毒仔豬免疫后兩次攻毒雖不產生臨床癥狀, 但可隱性帶毒造成垂直傳播; 低水平的母源抗體不能抵抗野毒的感染, 而主動免疫后的抗體水平只要在 8 倍以上, 均能抵抗強毒的攻擊。再次提示, 適當加大免疫劑量可以適應田間的帶有母源抗體仔豬的免疫。

人工試驗條件, 超前免疫( 0～35～70 日齡) 和 20～60 日齡免疫程序其免疫保護效果完全相同, 而且優于0～70 日齡兩次和 0日齡一次免疫的免疫效果。

超前免疫后不同時間吃初乳對疫苗免疫效果的影響各不相同; 試驗還證明不論吸初乳后 0. 5h或 1 h注苗, 疫苗免疫效果均不如超前免疫的效果好。因此在養豬生產中應堅持超前免疫。

除此之外, 疫苗運輸的冷鏈系統不完善、診斷方法不特異等多方面原因也是引起豬瘟免疫失敗的原因。

綜上所述豬瘟的免疫失敗是由上述多方面原因造成, 豬瘟的預防控制是一個復雜的系統工程。因此對后備種豬群和種豬群進行凈化是防止產生繁殖障礙和惡性循環的關鍵手段, 清除持續感染帶毒豬, 培育健康的無豬瘟帶毒豬的種豬和后備種豬群是豬瘟綜合防制技術的核心; 制定合理、有效的免疫程序是提高群體免疫水平的技術保障; 改善生態環境, 控制其他非豬瘟傳染病是實施豬瘟綜合防制技術的基礎。

作者：王琴, 寧宜寶
( 中國獸醫藥品監察所　國家豬瘟參考實驗室, 北京海淀 100081)