飼料抗氧化劑作用機(jī)理及其活性評價(jià)方法研究進(jìn)展

007畜牧

　

       作者：　魏金濤 齊德生 張妮婭
　　飼料內(nèi)的脂類化合物在儲存過程中不斷的進(jìn)行氧化反應(yīng)，造成飼料的感光性質(zhì)下降、營養(yǎng)價(jià)值降低、儲存期縮短和適口性下降，氧化嚴(yán)重的可以導(dǎo)致飼料酸敗、蛋白質(zhì)破壞和色素氧化，而且還具有一定的毒性，對畜禽造成一定程度的危害，常常給飼料行業(yè)和畜禽養(yǎng)殖業(yè)帶來較大的損失。抗氧化劑（Antioxidant）是一類能夠有效阻止或者延緩脂類化合物自動氧化的物質(zhì)，是指在相對可氧化底物(糖類、脂質(zhì)、DNA或蛋白質(zhì)等)濃度更低的情況下，能有效地延緩或阻止底物發(fā)生氧化反應(yīng)的物質(zhì)(Halliwell，1990)，是飼料工業(yè)生產(chǎn)中不可缺少的一種添加劑。但目前對抗氧化劑作用機(jī)理及其活性評價(jià)方法的研究尚不多見，本文就飼料用抗氧化劑的作用機(jī)理及其活性的評價(jià)方法做一綜述。
　　1 飼料抗氧化劑的作用機(jī)理
　　1.1 飼料中油脂的氧化過程
　　在有空氣存在的情況下，油脂的氧化反應(yīng)主要有自動氧化反應(yīng)、光氧化反應(yīng)、酶催化反應(yīng)、金屬催化氧化反應(yīng)4種類型，其中自動氧化反應(yīng)是食用油脂和有機(jī)食品品質(zhì)劣變的最主要原因。脂類的自動氧化反應(yīng)極為復(fù)雜，從理論上講，它是一個自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：①不飽和脂肪酸的自動氧化產(chǎn)物是氫過氧化物；②自由基的清除劑能阻止或延緩脂類的自動氧化，相反，自由基的誘發(fā)劑能加速自動氧化反應(yīng)；③90％以上的亞油酸自動氧化產(chǎn)物共軛化了，且其中一個雙鍵變成了反式。
　　1.2 自由基清除劑
　　自由基又稱游離基，是外層軌道含有未配對電子的原子、原子團(tuán)或者特殊狀態(tài)的分子的總稱，是攜有單電子的、活性極高的化學(xué)質(zhì)點(diǎn)(Fang，2002)。自由基以氧自由基為主，主要包括：超氧陰離子自由基、羥自由基、單線態(tài)氧、過氧化氫以及由此衍生的氫過氧基、烷氧自由基、烷基過氧化物自由基、氫過氧化物等。自由基氧化及其中間產(chǎn)物嚴(yán)重?fù)p害生物膜、酶、維生素、蛋白質(zhì)及活細(xì)胞功能，其中一些還是公認(rèn)的致癌物質(zhì)（Marx，1987）。飼料中的油脂可以自動氧化產(chǎn)生一定量的自由基，通過與油脂或單質(zhì)氧作用，或相互作用加劇了油脂氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的傳遞速度，對油脂的氧化起到了推波助瀾的作用。
　　一些抗氧化劑可以作為自由基清除劑，這些抗氧化劑能借助鍵的均裂，釋放出體積小、親合性很強(qiáng)的氫自由基，被鏈?zhǔn)椒磻?yīng)生成的自由基俘獲而生成分子態(tài)化合物，將高勢能、極活潑的自由基轉(zhuǎn)變?yōu)檩^穩(wěn)定的分子，從而中斷了鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的傳遞，阻止了油脂被進(jìn)一步氧化。作為自由基清除劑的抗氧化劑必須具備兩個條件:一是它本身給出氧自由基的均裂能較低，即極容易給出氫自由基；二是它自身轉(zhuǎn)變成的自由基較油脂氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)生成的自由基更能穩(wěn)定存在。
　　酚類飼料抗氧化劑，如沒食子酸丙酯、丁基羥基茴香醚、二丁基羥基甲苯、叔丁基對苯二酚及生育酚等主要是通過抽氫反應(yīng)產(chǎn)生較穩(wěn)定的苯氧自由基來終止鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。當(dāng)活潑氫與自由基結(jié)合，酚類抗氧化劑就可以起到清除自由基的作用，脫氫以后，酚變成自由基，而且脫氫后體系比較穩(wěn)定。酚類母體分子在抽氫后生成苯氧自由基，苯氧自由基的活性越強(qiáng)，苯氧自由基越穩(wěn)定，抗氧化劑清除自由基的活性越強(qiáng)(Wang等，2001；李新芳等，2005)。茶多酚也屬于酚類化合物，它含有多個游離酚羥基，能提供氫質(zhì)子與體內(nèi)自由基結(jié)合，達(dá)到清除自由基的目的，并在與自由基反應(yīng)的過程中，分子內(nèi)形成氫鍵，生成穩(wěn)定的自由基中間體，抑制原來的自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從而保護(hù)生物體免遭自由基的損傷(林春蘭等，2002)。黃酮類飼料抗氧化劑可以視為酚類飼料抗氧化劑的衍生物，可以通過酚羥基與氧自由基反應(yīng)(Robak等，1988；Lu等，2001)形成共振穩(wěn)定的半醌式自由基而中斷鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，因此共振半醌式自由基的穩(wěn)定性與抗氧化劑活性成正相關(guān)。茶多酚(PT)可以提供活潑氫，能將氫自由基提供給不飽和脂肪酸，過氧游離基形成氫過氧化物，阻止脂肪酸形成新的自由基(姜紹通等，1999)。甾醇類抗氧化劑也是這類自由基清除劑，它的作用模式是側(cè)鏈上的烯丙基甲基上給出一個氫原子(傳遞給過氧化物自由基)，而后異構(gòu)化變成一個相應(yīng)的較氫過氧化物更穩(wěn)定的烯丙基自由基。大蒜提取物也是由于其成分分子中有亞甲基亞砜及烯丙基結(jié)構(gòu)，可以提供活潑氫與自由基反應(yīng)，自身形成自由基共振雜化被穩(wěn)定(李愛軍等，2001)。維生素E是天然生育酚的化合物，是生育酚、三烯生育酚以及能夠或多或少地顯示d-α-生育酚活性的衍生物的總稱(Bramley等，2000)，它也是一種自由基清除劑，通過清除氧自由基或干擾氧化物鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來阻止氧化反應(yīng)，保護(hù)脂質(zhì)膜免遭自由基攻擊，是最重要的脂溶性斷鏈型抗氧化劑。維生素E是氧自由基的直接清除劑，與GSH-Px協(xié)同作用作為脂質(zhì)過氧化作用的阻斷劑。在大多數(shù)情況下，維生素E的抗氧化作用是與脂氧自由基或脂過氧自由基反應(yīng)，向它們提供氫離子，使脂質(zhì)過氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中斷(Thomos等，1996；Korotdova等，2004；劉成梅等，2005)。
　　1.3 還原保護(hù)劑
　　還原保護(hù)劑通過自身被氧化,除去彌漫于飼料中的氧氣而延緩氧化反應(yīng)的發(fā)生。可以作為還原保護(hù)劑的化合物主要有抗壞血酸、抗壞血酸棕櫚酸酯、異抗壞血酸、異抗壞血酸鈉等(王紹美等，2000；黃紹華等，1999)。這些物質(zhì)具有極強(qiáng)的還原性，與飼料中的氧氣有極強(qiáng)的親和力，并與其發(fā)生化學(xué)反應(yīng)除去飼料中的氧氣，自身被氧化為脫氫抗壞血酸和半脫氫抗壞血酸，在氧存在條件下，脫氫抗壞血酸和半脫氫抗壞血酸又不可逆的降解為二酮古羅糖酸，最終分解為草酸和蘇糖酸。這類抗氧化劑往往還對其它抗氧化劑具有一定的協(xié)同作用。孟杰等(2001)試驗(yàn)表明，維生素C對黃岑提取物有一定的協(xié)同抗氧化作用。莫鳳奎等(1997)認(rèn)為，維生素C對維生素E的抗氧化作用具有明顯的協(xié)同作用。王紹美等(2000)還認(rèn)為，維生素C對茶多酚的抗氧化作用有顯著的協(xié)同作用。此外，有研究表明，大量的維生素C可以起到抗氧化的作用，但是少量的維生素C卻起到促氧化的作用，主要是因?yàn)榫S生素C在鐵離子等過渡金屬離子存在的條件下，可以誘發(fā)脂質(zhì)的過氧化反應(yīng)(Hama等，1989)。
　　1.4 金屬離子清除劑
　　飼料中的金屬離子可以給畜禽提供微量元素營養(yǎng)，在飼料的加工過程中飼料接觸金屬容器，可以使飼料增加一些金屬離子，這些金屬離子，特別是重金屬，具有二價(jià)或更高價(jià)態(tài)，且在它們之間有合適的氧化還原電勢(例如鈷、銅、鐵、鎂等)可以縮短鏈?zhǔn)椒磻?yīng)引發(fā)期的時間，加快飼料中脂類化合物氧化的速度。已經(jīng)證明，金屬和金屬鹽的卟啉環(huán)絡(luò)合物濃度為10-8 mol/l時產(chǎn)生強(qiáng)氧化效應(yīng)。含有氧配位原子的絡(luò)合劑可以作為抗氧化劑，因?yàn)樗鼈兛梢院徒饘匐x子絡(luò)合后降低氧化還原電勢，穩(wěn)定金屬離子的氧化態(tài)，有效的抑制金屬離子的促氧化作用。Aruomo等（1990）和張?zhí)煨愕?1998)均認(rèn)為，EDTA是一種較好的防霉促褐變的抗氧化劑。另外，檸檬酸、多磷酸鹽、卵磷脂等也是這類抗氧化劑。
　　1.5 其它抗氧化劑
　　有些抗氧化劑的作用機(jī)制兼具多重特性。磷脂既有絡(luò)合金屬離子清除氧化強(qiáng)化劑的作用，又有通過鍵的均裂析出氫自由基，消除鏈?zhǔn)椒磻?yīng)自由基的作用。美拉德反應(yīng)的中間產(chǎn)物——還原銅也具有這種雙重特性，不但借助鍵的均裂給出氫自由基，而且能夠清除氧化強(qiáng)化劑金屬離子。還有些抗氧化劑，如畜禽體內(nèi)的超氧化物歧化酶，能將過氧化物自由基催化生成分子態(tài)的物質(zhì)，避免這些自由基參與油脂氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的傳遞，中止了鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從而起到抗氧化作用；但它本身只起催化作用，不同于上述各類抗氧化劑的作用機(jī)制。畜禽體內(nèi)的動脈粥樣硬化就是由于這種超氧化物歧化酶(SOD)數(shù)量減少，致使脂肪沉積于動脈管壁而導(dǎo)致動脈粥樣硬化。有些抗氧化劑卻是通過阻擋空氣中的氧氣進(jìn)入油脂內(nèi)部，保護(hù)油脂免受氧化；或者抑制油脂表層上的空氣對流，減少氧氣滲透到油脂內(nèi)部，而起到抗氧化作用，如甲基硅酮在油脂表面形成一惰性物理屏障層，阻止空氣進(jìn)入油內(nèi)。
　　2 抗氧化劑活性評價(jià)
　　評價(jià)飼料抗氧化劑抗氧化活性的方法有很多種，具體有：①在指定的時間測定氧化產(chǎn)物或官能團(tuán)的濃度或者吸光度值；②測定反應(yīng)的速率；③測量誘導(dǎo)期(延滯期)或氧化達(dá)到一定程度所需的時間；④測量速度的積分(即動力學(xué)曲線下的面積)；⑤測定被測物產(chǎn)生與標(biāo)準(zhǔn)抗氧化劑相對作用的濃度。這些方法都是為了說明飼料抗氧化劑在特定條件下具有抑制底物氧化或者清除自由基的能力。
　　2.1 抗氧化劑作用的底物
　　以抗氧化劑抑制脂質(zhì)氧化為基礎(chǔ)的測量抗氧化活性的方法使用最多。常使用純的甘油三酸酯、植物油(紅花油、葵花油、大豆油、橄欖油等)、魚油或豬油作為氧化反應(yīng)的底物，也使用磷脂或脂蛋白作為底物。海產(chǎn)品油中富含多不飽和脂肪酸，能降低血清甘油三酸酯和膽固醇含量，減少血栓癥、心臟病、高血壓以及其它的炎癥和自身免疫性疾病的發(fā)生，因此也常使用海產(chǎn)品油作為底物（Nieto等，1993）。Satue等（1995）用不同商業(yè)來源的橄欖油作為底物研究天然抗氧化劑的抗氧化活性也得到了很好的結(jié)果。
　　多不飽和脂肪酸對氧化變質(zhì)高度敏感，也常用作測定天然抗氧化劑活性的底物，如亞油酸。為了避免得到重復(fù)性的結(jié)果，選擇底物時應(yīng)優(yōu)先考慮單一的物質(zhì)，如亞油酸或亞油酸甲酯。不推薦使用植物油或血漿等生物試樣作為底物，因?yàn)樗鼈兪腔旌衔铮峁┩耆嗤牡孜锸遣豢赡艿摹４送猓孜镏泻械目寡趸瘎?如植物油中常含有VE) 也能參與測試過程，干擾測定。但是實(shí)際測定中常使用植物油等脂質(zhì)混合物，因?yàn)樗鼈兪桥c真實(shí)食品有關(guān)的脂質(zhì)成分，因此，實(shí)際操作中應(yīng)根據(jù)具體的測試方法選擇合適的底物和測試體系。
　　2.2 化學(xué)方法檢測抗氧化劑活性
　　化學(xué)檢測主要是測定飼料中油脂被氧化后的產(chǎn)物的量，主要的測定指標(biāo)有脂肪酸值（酸價(jià)）、過氧化值、TBA值。
　　飼料中的游離脂肪酸用氫氧化鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，每克飼料消耗氫氧化鉀的毫克數(shù)即為飼料的酸價(jià)(Acid value，AV)。一般對動物源性飼料使用“酸價(jià)”這個名稱，而對谷物類飼料原料測定時不用“酸價(jià)”這個名稱，常用“脂肪酸值”。脂肪酸值(Fatty Acid Value)是指100 g樣品消耗的氫氧化鉀的毫克數(shù)。但是無論是“酸價(jià)”還是“脂肪酸值”，實(shí)質(zhì)都是用較低濃度的強(qiáng)堿去中和弱酸(以酚酞為指示劑)。在飼料原料中都含有一定量的脂肪類物質(zhì)，如果發(fā)生變質(zhì)，其所含脂肪便會分解產(chǎn)生游離脂肪酸，“酸價(jià)”和“脂肪酸值”升高。但是酸價(jià)的化學(xué)本質(zhì)是脂肪水解產(chǎn)物的多少， 指的是游離脂肪酸從甘油三酸酯上脫離的程度， 而并不是脂肪氧化產(chǎn)物的數(shù)量（張本軍等，2004）。
　　飼料在儲藏的過程中，其中的油脂在脂肪酸酶、微生物和空氣中氧氣的作用下產(chǎn)生過氧化物。過氧化物是油脂變質(zhì)過程中的中間產(chǎn)物，是油脂酸敗的初期標(biāo)志。過氧化物進(jìn)一步氧化分解，最后分解成為各種低分子的醛、酮、羧酸及其它氧化物，使飼料中的油脂酸敗。揮發(fā)性的醛、酮等物質(zhì)使酸敗的脂肪變色、變味，使其完全失去飼用價(jià)值。飼料中過氧化物的含量通常以過氧化值來表示，所以，人們也常用過氧化值（Peroxide value，PV）這個指標(biāo)來判斷飼料的新陳程度和變質(zhì)情況，過氧化值隨著飼料儲藏溫度和儲藏時間的變化而發(fā)生不同的變化。過氧化值雖然能夠反映脂肪氧化酸敗的初級程度， 但它只說明脂肪氧化的中間產(chǎn)物——羰基過氧化物的積累程度， 這些過氧化物一般不穩(wěn)定， 容易進(jìn)一步發(fā)生其它氧化反應(yīng)生成低分子化合物， 導(dǎo)致脂肪完全酸敗， 此時過氧化值卻不一定高， 因此也具有局限性。
　　TBA值是指利用脂肪的主要氧化終產(chǎn)物——丙二醛與硫代巴比妥發(fā)生呈色反應(yīng)，并在532 nm處有特征吸收，利用吸收強(qiáng)度和丙二醛的濃度在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，可用來測定脂肪氧化程度的方法，是反映肉類制品在貯藏過程中氧化變質(zhì)程度的直接指標(biāo)， 也是反映肉類食品安全性的一個重要指標(biāo)。此方法在西方國家普遍使用， 常用于生肉鮮度的測定，在飼料工業(yè)中也可以使用。植物器官衰老或在逆境條件下遭受傷害，往往發(fā)生膜脂過氧化作用，膜脂過氧化的最終產(chǎn)物也是丙二醛。由于TBA值測定的是油脂氧化的最終產(chǎn)物，因此用TBA值去評價(jià)抗氧化劑的抗氧化活性是比較合理的。
　　2.3 清除自由基能力的評價(jià)
　　清除自由基能力評價(jià)的方法很多，如ABTS法、DMPD法、DPPH法、Fremy自由基和galvinoxyl法（Peter等，2001；王會等，2006）以及CuSO4－VC－H2O2酵母懸浮液體系化學(xué)發(fā)光檢測法、次黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶-魯米諾體系化學(xué)發(fā)光檢測法（楊廣花，2004；蔡志強(qiáng)等，2004）。
　　ABTS法最初用于測定組織樣品中血紅蛋白的含量，后來這個方法被Miller等(1993)加以改進(jìn)，用于測定生物樣品的抗氧化活性，并且廣泛應(yīng)用于食品和天然水溶性酚類物質(zhì)抗氧化活性的測定。ABTS 法廣泛用于評價(jià)抗氧化劑清除自由基的能力，此法快速簡單，可用于常規(guī)測定。Fogliano等(1999)提出的DMPD法與ABTS法類似，即在酸性條件下，DMPD(N，N-dimethyl-p-phenylenediamine)可被ABAP、FeCl3、CuCl2、H2O2氧化，生成穩(wěn)定的DMPD·+，它在505 nm處有最大吸收峰。根據(jù)加入抗氧化劑后吸光度的變化可測得樣品清除自由基的能力。DPPH·被廣泛用于定量測定生物試樣、酚類物質(zhì)和食品的抗氧化能力。DPPH·(2，2’-diphenyl-1-picrylhydrazyl，2，2-二苯代苦味酰基苯肼)是一種穩(wěn)定的自由基，其乙醇溶液顯紫色，在515 nm處有最大吸收峰。當(dāng)有供氫能力的抗氧化劑存在時(如酚類)，DPPH·溶液的顏色變淺，吸光度值變小，根據(jù)吸光度的變化可測得抗氧化劑的活性。婁紅祥等(2004)利用DPPH自由基捕獲分析了蛇葡萄根中茋類化合物的抗氧化活性。葉輝等(2004)用DPPH法對老鷹茶提取物抗氧化作用進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，DPPH法在研究抗氧化劑的活性方面是可行的。Fremy自由基和galvinoxyl法是根據(jù)穩(wěn)定的Fremy自由基(potassium nitroso disulphonate，五硫化二鉀)溶于水，合成的過氧自由基galvinoxyl[2， 6-di-tert-butyl-a-(3，5-di-tert-butyl-4-oxo-2，5-cyclohexadien-1-ylidene)-p-tolyloxy]溶于乙醇，它們能與供氫體反應(yīng)，分別用于測定茶葉中的水溶性和脂溶性抗氧化劑的活性。自由基濃度用電子自旋共振儀(ESR)測定，根據(jù)自由基濃度的變化可知抗氧化劑的活性。楊廣花(2004)及蔡志強(qiáng)等(2004)使用超微弱發(fā)光儀，采用CuSO4－VC－H2O2酵母懸浮液體系化學(xué)發(fā)光檢測法測定發(fā)光強(qiáng)度，比較幾種天然抗氧化劑清除OH-的能力；采用次黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶-魯米諾體系化學(xué)發(fā)光檢測法測定發(fā)光強(qiáng)度，比較幾種天然抗氧化劑清除O2-的能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，幾種天然抗氧化劑都具有清除OH- 和O2-的能力。
　　2.4 抗氧化劑活性的理論評價(jià)
　　近年來發(fā)現(xiàn)，除了傳統(tǒng)的試驗(yàn)評價(jià)抗氧化劑活性的方法之外，理論計(jì)算也是一種可行的方法，可以作為試驗(yàn)研究的輔助手段預(yù)先評估各種抗氧化劑的抗氧化活性（Zhang等，1999；Zhang 等，2003）。用理論評價(jià)的方法評價(jià)抗氧化劑活性首先要選取合適的理論參數(shù)來表征抗氧化劑的活性。目前普遍認(rèn)為酚類抗氧化劑通過兩種反應(yīng)機(jī)制清除自由基，即在非極性溶劑中，傾向于一步抽氫反應(yīng)；在極性溶劑中傾向于質(zhì)子轉(zhuǎn)移伴隨的電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，O-H鍵解離能（Bond Dissociation Enthalpy，簡稱BDE）是適合的表征自由基抽氫反應(yīng)速率的理論參數(shù)（張紅雨等，2000），電離電勢（ionization potential，IP）表征反應(yīng)速率取決于母體分子的給電子能力（王蘭芬等，2003）。由于BDE是基本的物化參數(shù)，有許多研究工作者致力于尋找準(zhǔn)確、簡便的計(jì)算BDE的方法。Wright等（1997）又提出了一種組合的密度泛函方法（Density Functional Theory，簡稱DFT），具體方法是用半經(jīng)驗(yàn)量子化學(xué)方法優(yōu)化分子結(jié)構(gòu)，并計(jì)算振動頻率和零點(diǎn)振動能（ZPVE），校正系數(shù)為0.947，然后用DFT方法計(jì)算分子的單點(diǎn)電子能量（SPE），最后根據(jù)公式計(jì)算BDE。
　　3 結(jié)語
　　飼料中的脂類物質(zhì)不斷地進(jìn)行氧化反應(yīng)，氧化生成的膽固醇氧化物導(dǎo)致酯類酸敗、蛋白質(zhì)破壞和色素氧化，造成飼料的變質(zhì)。為了保證飼料的儲存時間和品質(zhì)，抗氧化劑已經(jīng)成為飼料工業(yè)生產(chǎn)中不可缺少的一種添加劑，其作用效果和帶來的經(jīng)濟(jì)效益也越來越多地受到人們的歡迎和重視。但是飼料中添加抗氧化劑的抗氧化機(jī)理研究尚不透徹，其活性的檢測方法尚不完善，各種抗氧化劑具體的添加量也不確定，而且飼料的成分很多，被氧化的原因和過程都很復(fù)雜，添加單一的抗氧化劑未必可以起到預(yù)期的目的等，這些都還需要進(jìn)一步地去系統(tǒng)研究。
　　（參考文獻(xiàn)38篇，刊略，需者可函索，選自飼料工業(yè)）


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