精制禽流感高免卵黃抗體的研究

2007-7-1 18:34| 發(fā)布者: nety| 查看: 1217| 評論: 2

　禽流感是由流感病毒引起的一種烈性傳染病，對養(yǎng)禽業(yè)構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅。將禽流感病毒油乳劑滅活苗按一定的免疫程序給SPF蛋雞強(qiáng)化免疫，制備抗禽流感的高免卵黃液，用于治療禽流感取得了一定的效果。但粗制卵黃液中含有大量脂類及其他的雜蛋白，用于治療時(shí)存在注射困難，吸收不良，過敏反應(yīng)，保存期短和運(yùn)輸不便”。因此，我們對禽流感高免卵黃抗體進(jìn)行了純化研究。
    1 材料與方法
    1.1 疫苗禽流感油乳劑滅活苗，中牧股份實(shí)業(yè)有限公司鄭州生藥廠，批號030444。
    1.2 禽流感抗原山西省獸醫(yī)防治站提供。
    1.3試驗(yàn)用動物購自山東省家禽研究所的200日齡SPF產(chǎn)蛋雞和20日齡SPF小雞、太谷縣某養(yǎng)雞場200日齡非免疫產(chǎn)蛋雞30只及健康小鼠10只。
    1.4 免疫方法 SPF產(chǎn)蛋雞肌注禽流感油乳劑滅活苗1mL，首免后7～10d再次用該苗2mL進(jìn)行二免，二免后每隔3d用HI測定其卵黃效價(jià)，當(dāng)卵黃效價(jià)達(dá)2E10以上即可收集雞蛋，用于制備卵黃液。以后每隔一定時(shí)間強(qiáng)化免疫1次，保證卵黃效價(jià)。
    1.5 卵黃液的制備選擇卵黃效價(jià)達(dá)2E10以上的高免蛋，分離蛋黃與滅菌蒸餾水按1∶1稀釋，充分?jǐn)嚢瑁４鎮(zhèn)溆谩?nbsp;
    1.6 1gY的純化制備好的卵黃液中加入相當(dāng)與原卵黃體積8倍、4℃預(yù)冷的酸性蒸餾水，邊加邊攪拌，4℃保溫靜置過夜，取上清液，上清液用濾布過濾，過濾液進(jìn)行超濾濃縮，濃縮倍數(shù)為4，所得超濾液中加入硫柳汞至終濃度為0.01%，用0.22μm微孔濾膜過濾除菌，即為精制禽流感高免卵黃抗體。
    1.7 抗體效價(jià)檢測采用血凝抑制試驗(yàn)。
    1.8 無菌檢驗(yàn) 2.0mL精制禽流感高免卵黃抗體分別接種普通瓊脂培養(yǎng)基、血液瓊脂斜面和厭氧肉湯中，37℃培養(yǎng)48h，觀察有無細(xì)菌生長。
    1.9 安全試驗(yàn) 健康小鼠10只，每只皮下注射本品1mL；20日齡SPF小雞10只，每只皮下注射本品5mL，觀察2周。
    1.10 動物試驗(yàn) 取200日齡非免疫產(chǎn)蛋雞30只，隨機(jī)分為3組，第1組為健康對照組，不注射任何藥物，隔離飼養(yǎng)。第2和第3組每只雞肌注、點(diǎn)眼、滴鼻接種EID50AIV種毒0.2mL。攻毒后24h分別給第2組雞皮下注射本品2.0mL，第3組皮下注射生理鹽水2.0mL。觀察10d，記錄每組雞發(fā)病、死亡情況。
    1.11 脫脂率與蛋白質(zhì)回收率的測定用紫外分光光度計(jì)測定精制禽流感高免卵黃抗體在A280和A260處的吸光度，按紫外吸收差法測定蛋白質(zhì)的含量，計(jì)算公式：蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）＝（1.45×A280－0.74×A260）。脂肪含量測定采用香草醛顯色法。
    1.12 保存期試驗(yàn) 將精制禽流感高免卵黃抗體分別保存在室溫4℃和～20℃，每月測定一次HI效價(jià)。
    2 結(jié)果
    2.1 物理性狀應(yīng)為無色或淡黃色液體，放置一段時(shí)間后瓶底有少量沉淀，pH值呈中性。
    2.2 無菌檢驗(yàn) 2.0mL精制禽流感高免卵黃抗體分別接種普通瓊脂培養(yǎng)基、血液瓊脂斜面和厭氧肉湯中，37～12培養(yǎng)48h，未見有任何細(xì)菌生長。
    2.3 安全試驗(yàn) 健康小鼠10只，每只皮下注射本品2mL；20日齡SPF小雞10只，每只皮下注射本品5mL，觀察2周，未發(fā)現(xiàn)任何異常，精神狀態(tài)和生長情況良好，證明精制禽流感高免卵黃抗體是安全可靠的。
    2.4 動物試驗(yàn) 第1組健康狀況良好，無發(fā)病死亡。第3組在攻毒后24～48h開始發(fā)病，出現(xiàn)死亡，72h全部發(fā)病，7d內(nèi)死亡8只。第2組在注射精制禽流感高免卵黃抗體后12h即攻毒后36h有4只雞發(fā)病，發(fā)病后12～24h，其中1只死亡，其余3只均恢復(fù)正常。證明該卵黃抗體確實(shí)起到了中和病毒的作用。
    2.5 脫脂率與蛋白質(zhì)含量沉淀中的脂肪經(jīng)香草醛顯色法測定含量為95.7%，精制卵黃抗體中蛋白質(zhì)含量經(jīng)紫外吸收差法測定為9.47mg/mL，該純化卵黃抗體的方法去脂效果好，IgY回收率比較高。
    2.6 保存期試驗(yàn) 精制禽流感高免卵黃抗體室溫條件下可保存10個(gè)月，4～12條件下保存15個(gè)月，-20℃條件下保存18個(gè)月。
    3 小結(jié)與討論
    3.1 禽流感是Ⅰ類烈性傳染病，一旦發(fā)病，將對養(yǎng)雞業(yè)造成嚴(yán)重的威脅，用禽流感油苗免疫蛋雞制備高免卵黃液，給發(fā)病雞注射，隨著抗體的擴(kuò)散直接中和體內(nèi)的病毒，使雞體在短時(shí)間內(nèi)獲得迅速保護(hù)，發(fā)揮了緊急預(yù)防和緊急治療的作用。精制禽流感高免卵黃抗體對200日齡非免疫產(chǎn)蛋雞及20日齡SPF小雞安全可靠，有較好的保護(hù)作用，在生產(chǎn)實(shí)踐中可以推廣應(yīng)用。
    3.2 卵黃液中含有大量的脂類和雜蛋白，對IgY的吸收造成影響，經(jīng)過純化去掉了脂類和雜蛋白，純化后的IgY不但易于注射，而且易于吸收，治療效果好。該純化過程采用水稀釋法，在此基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，與PEG沉淀法、氯仿抽提法、硫酸鈉沉淀法等純化方法比較，水稀釋法成本低，易于操作，實(shí)驗(yàn)條件簡單，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
    3.3 現(xiàn)已報(bào)道有治療新城疫、法氏囊、禽腦脊髓炎的各種卵黃液，用于治療相應(yīng)的疾病，取得了較好的治療效果。但禽流感亞型眾多，變異性極強(qiáng)，所以應(yīng)進(jìn)行本地毒株分離，制備油苗免疫，這樣制備的卵黃抗體更有針對性，預(yù)防和治療的效果會更好。
    3.4 制備卵黃抗體的蛋主要來自普通的產(chǎn)蛋雞，這樣就會造成一些疾病的垂直傳播，可以采用非免疫雞群，排除一些蛋傳疾病，也可將制備好的卵黃抗體進(jìn)行60Coγ射線輻射滅菌，同樣可以達(dá)到滅菌的目的。
    3.5 由于除去了大部分的脂類，精制禽流感高免卵黃抗體的保存期比普通卵黃抗體的保存期延長，給卵黃抗體的運(yùn)輸和貯藏帶來了方便。
    3.6 從免疫雞卵黃中提取特異性IgY抗體，是一種預(yù)防和治療動物和人類某些疾病的優(yōu)質(zhì)便利的好途徑，在生物制品的開發(fā)和綜合利用方面有廣闊的前景，隨著對IgY制備和純化方法的不斷改進(jìn)以及研究的不斷深入其應(yīng)用將進(jìn)一步擴(kuò)大。

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