制備有機鉻添加劑—鉻酵母的研究

apple12151007 2011-1-4 15:56

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簡介

利用生物合成法制備了一種有機鉻含量較高的新型添加劑——鉻酵母，并采用分光光度法及透析處理測定了鉻酵母中總鉻和有機鉻的含量，從而確定了鉻酵母的最佳制備條件。

制備有機鉻添加劑——鉻酵母的研究

郝素娥　陳慶峰　劉旭　劉亞斌

　　摘　要　利用生物合成法制備了一種有機鉻含量較高的新型添加劑——鉻酵母，并采用分光光度法及透析處理測定了鉻酵母中總鉻和有機鉻的含量，從而確定了鉻酵母的最佳制備條件為：培養基采用麥芽汁+尿素，培養基中三氯化鉻的添加量為1.6 μg。ml－1，啤酒酵母的接種量為3%，培養溫度為30 ℃，培養時間為48 h。
　　關鍵詞　鉻酵母　有機鉻　添加劑
　　1　前言
　　鉻是生物體必需的微量營養元素，人體缺鉻會產生葡萄糖、脂肪、蛋白質代謝障礙，引起各種疾病，如動脈粥樣硬化、糖尿病、冠心病、末梢神經炎、近視眼等，尤其嬰兒缺鉻易患消瘦性蛋白質營養不良癥［1］；動物缺鉻表現為膽固醇或血糖升高、生長遲緩、免疫力下降、繁殖能力降低和壽命縮短等，如禽類喂含鉻量低于5 μg。kg－1的飼料日糧時，羽毛大量脫落；用低鉻日糧喂兔，則母兔產仔率下降；用無鉻日糧喂種公牛，精液量大大減少，精子畸形率顯著提高。當補鉻后，癥狀消失［2］。
　　在研究鉻的補充時，主要有無機鉻(常用CrCl3。6H2O、Cr2(SO4)3、Cr(NO3）3）和有機鉻(常用煙酸鉻、蛋白螯合鉻、鉻酵母)兩種形式。鉻的生物活性的發揮需要三價鉻，鉻主要以Cr3＋構成葡萄耐量因子(GTF)，協助胰島素作用，影響糖類、脂類、蛋白質和核酸的代謝。鉻進入體內，經腸道吸收，在血液里與運送鐵的球蛋白結合，而后被運至肝臟及全身。由于不同形式的鉻在組織中的結合程度不同，導致吸收率不同，因此鉻的吸收與化學結合形式有很大關系，飼料中的總鉻含量不能反映可利用鉻或鉻的營養狀況。無機鉻不但毒性大，且以極低水平吸收，約為0.4%～3％；有機鉻安全性高，且易被吸收，吸收率約為10%～25%［3］。瑞士聯邦學院畜牧所Gebert和Wenkin的研究表明，煙酸鉻和酵母鉻的效果明顯好于氯化鉻，尤以酵母鉻最佳［4］。鉻酵母是以生物方法制備的，具有生物活性高、毒性小、生產成本低等特點，可以認為是一種具有較好應用前景的鉻的補充物。
　　本文利用生物合成法制備了有機鉻含量較高的鉻酵母，并對所制備的鉻酵母中的總鉻和有機鉻的含量進行了分析測定，從而確定了制備鉻酵母的最佳條件，為鉻酵母今后在醫藥及添加劑領域的應用奠定了必要的基礎。
2　實驗方法
2.1　鉻酵母的制備過程
　　培養基調制→滅菌→濾蛋白→添加氯化鉻→滅菌→接種酵母菌→培養→離心→水洗→干燥→粉碎→成品
2.2　鉻酵母中總鉻及有機鉻含量的測定
　　鉻(Ⅵ)可與對氨基二乙基苯胺發生氧化反應，生成紅色化合物，利用分光光度法可以測定鉻酵母中的鉻含量，最大吸收波長為540 nm［5,6］。
　　鉻酵母經消化進行測定，即為鉻酵母中的總鉻含量；將鉻酵母進行透析處理，使有機鉻與無機鉻分離，便可測得鉻酵母中有機鉻的含量。
3　實驗結果與討論
　　在鉻酵母的制備過程中，鉻酵母中的總鉻含量及有機鉻含量與培養基的種類、培養基中CrCl3。6H2O的添加量、酵母菌種及其接種量、以及培養溫度和培養時間均有關。
3.1　培養基的種類對鉻酵母中鉻含量的影響
　　文中采用了四種不同的培養基進行實驗，實驗結果見表1。

表1　培養基對鉻酵母中鉻含量的影響μg/g

培養基種類

麥芽汁

麥芽汁＋尿素

麥芽汁+葡萄糖

人工培養基

總鉻
有機鉻

84.28
75.05

124.75
109.36

122.40
101.88

91.65
67.48

　　從表1可以看出，當麥芽汁中添加一定量尿素或葡萄糖時，酵母對培養基的利用率較高，其轉化無機鉻為有機鉻的能力也較強；利用人工培養基(葡萄糖加無機鹽等)也可制備鉻酵母，但從制備效果和經濟效益上考慮，均不如采用天然培養基為好。
3.2　培養基中CrCl3。6H2O添加量對鉻酵母中鉻含量的影響
　　在鉻酵母的制備過程中，對鉻酵母中總鉻含量及有機鉻含量影響最大的因素是培養基中CrCl3。6H2O的添加量。由表2可知，隨著培養基中CrCl3。6H2O添加量的增加，鉻酵母中的總鉻含量及有機鉻的含量開始的時候亦呈增加趨勢，但達到一定水平后又呈下降趨勢。這說明酵母能夠利用培養基中的無機鉻并將其轉化為有機鉻，但培養基中無機鉻的濃度不能太高，濃度太高時會對酵母的生長產生抑制作用。培養基中CrCl3。6H2O的最佳濃度為1.6　μg。ml－1。

表2　CrCl3。6H2O添加量對鉻酵母中鉻含量的影響

CrCl3/μg。ml－1

0.4

0.8

1.2

1.6

2.0

2.4

總鉻/μg。g－1
有機鉻/μg。g－1

40.08
28.25

77.64
53.19

113.15
90.92

124.75
109.36

108.76
88.12

89.35
69.87

3.3　酵母菌種及接種量對鉻酵母中鉻含量的影響
　　分別用面包酵母和啤酒酵母進行實驗，在相同的實驗條件下，用面包酵母的時候，鉻酵母的總鉻含量較高，而用啤酒酵母時，雖總鉻含量稍低些，但其有機鉻含量卻較高，因此認為還是啤酒酵母較好些，實驗結果見表3。另外，酵母菌的接種量對實驗結果也有一定的影響，實驗表明，接種量為3%時，效果最好。

表3　酵母菌種對鉻酵母中鉻含量的影響

酵母菌種

面包酵母

啤酒酵母

總鉻/μg。g－1
有機鉻/μg。g－1

90.05
67.96

84.28
75.05

3.4　培養溫度和培養時間對鉻酵母制備的影響
　　培養溫度和培養時間對鉻酵母中總鉻含量及有機鉻含量亦有一定的影響。分別進行了培養溫度為20 ℃，25 ℃，30 ℃，35 ℃，40 ℃培養時間為24 h，36 h，48 h，60 h,72 h的實驗，結果表明，當培養溫度為30 ℃，培養時間為48 h時，鉻酵母的制備效果最好。
3.5　鉻酵母的紅外光譜分析
　　在鉻酵母的紅外分析譜圖上可以看出(圖1)，在3 371.37 cm-1，1 654.83 cm－1，1 237.26 cm－1，521.71 cm－1處有較強的吸收峰，它們分別為氨基，碳—碳鍵，羧基，以及三價鉻的吸收峰，且發生了不同程度的移動，這說明在鉻酵母中存在著碳—鉻鍵，鉻是以有機鉻的形式存在的，而且很有可能是以鉻氨基酸的形式存在的［7］。由于含鉻氨基酸的標準樣難以得到，鉻酵母中有機鉻的準確形式還有待于進一步研究。

　　綜上所述，當采用天然培養基麥芽汁，其中加一定量尿素，并添加1.6　μg。ml－1的CrCl3。6H2O，啤灑酵母的接種量為3%，培養溫度為30 ℃，培養時間為48 h時，可制得總鉻及有機鉻含量較高的鉻酵母，總鉻含量可達124.75　μg。g－1，有機鉻含量可達109.36　μg。g－1。
　　鉻酵母作為一種生理活性高，毒性小，成本低的有機鉻添加劑，其開發生產必將產生巨大的社會效益和經濟效益。
作者單位：哈爾濱工業大學應用化學系(150001)

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